Entkopplung von Atmungsraten und Abundanz im marinen Prokaryoplankton

Nature Band 612, Seiten 764–770 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Der CO2-Austausch zwischen Ozean und Atmosphäre hängt weitgehend vom Gleichgewicht zwischen mariner mikrobieller Photosynthese und Atmung ab. Trotz der großen taxonomischen und metabolischen Vielfalt unter marinen Planktonbakterien und Archaeen (Prokaryoplankton)1,2,3 wird ihre Atmung normalerweise in großen Mengen gemessen und in globalen biogeochemischen Modellen als „Black Box“ behandelt4; Dies schränkt das mechanistische Verständnis des globalen Kohlenstoffkreislaufs ein. Hier zeigen wir mithilfe einer Technologie für integrierte Phänotypanalysen und Genomsequenzierung einzelner mikrobieller Zellen, dass sich die zellspezifischen Atmungsraten zwischen Prokaryoplankton-Gattungen um mehr als das 1.000-fache unterscheiden. Es wurde festgestellt, dass der Großteil der Atmung von Minderheitsmitgliedern des Prokaryoplanktons (einschließlich des Roseobacter-Clusters) durchgeführt wird, wohingegen Zellen der häufigsten Abstammungslinien (einschließlich Pelagibacter und SAR86) extrem niedrige Atmungsraten aufwiesen. Die Entkopplung der Atmungsraten von der Abundanz zwischen den Abstammungslinien, die erhöhte Anzahl von Proteorhodopsin-Transkripten in Pelagibacter- und SAR86-Zellen und die erhöhte Atmung von SAR86 in der Nacht deuten darauf hin, dass die auf Proteorhodopsin basierende Phototrophie3,5,6,7 wahrscheinlich eine wichtige Energiequelle für Prokaryoplankton darstellt und möglicherweise Steigerung der Wachstumseffizienz. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Abhängigkeit des Prokaryoplanktons von der Atmung und der Remineralisierung von aus dem Phytoplankton stammendem organischen Kohlenstoff zu CO2 für seinen Energiebedarf und sein Wachstum geringer sein könnte als allgemein angenommen und je nach Abstammungslinie unterschiedlich sein könnte.

Der Black-Box-Ansatz zur Prokaryoplankton-Atmung stellt einen starken Kontrast zu den überwältigenden Beweisen für die beträchtliche phylogenetische und genomische Diversität des Prokaryoplanktons1,2,3 und die enormen Unterschiede im Wachstum und den Aufnahmeraten organischer Substrate zwischen den Abstammungslinien dar, wie aus der Mikroautoradiographie-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (MAR) hervorgeht -FISH)8, FISH-nanoskalige Sekundärionen-Massenspektrometrie (nanoSIMS)9 und stabile Isotopensondierung (SIP)10. Einige der vom Genom vorhergesagten Stoffwechselprozesse, wie z. B. die auf Proteorhodopsin basierende Phototrophie3,5,6, können einen direkten Einfluss auf die Atmung des Prokaryoplanktons und die CO2-Freisetzung in die Atmosphäre haben, ihre globale Bedeutung bleibt jedoch kaum begrenzt. Hier haben wir eine Methode zur integrierten In-situ-Messung der Sauerstoffatmungsfrequenz und Genomsequenzierung einzelner mikrobieller Zellen entwickelt, um zu zeigen, dass sich die Atmungsfrequenzen zwischen Prokaryoplankton-Gattungen um mehr als drei Größenordnungen unterscheiden. Unsere Ergebnisse liefern Belege für die Bedeutung der Proteorhodopsin-Phototrophie als ergänzende Energiequelle zur Atmung in vorherrschenden Prokaryoplankton-Linien und ihre möglichen Auswirkungen auf den globalen Kohlenstoffkreislauf. Diese Ergebnisse belegen die Machbarkeit einer direkten Verknüpfung mikrobieller Genome und Phänomene bei Einzelzellauflösung und unterstreichen die Bedeutung der Aufteilung der marinen Prokaryoplankton-Blackbox in funktionell bedeutungsvollere Komponenten in Ökosystemmodellen.

RedoxSensor Green (RSG) wurde bereits in Labor- und Umweltstudien verschiedener Mikroorganismen als Sonde für die Lebensfähigkeit von Zellen verwendet, die spezifisch für die Oxidoreduktaseaktivität ist11. Um die Machbarkeit der quantitativen Verwendung von RSG zu bewerten, haben wir die Beziehung zwischen dem Massensauerstoffverbrauch und der RSG-Fluoreszenz einzelner Zellen in Reinkulturen phylogenetisch vielfältiger aquatischer Bakterien analysiert (der methodische Arbeitsablauf ist in der erweiterten Datenabbildung 1 und der Ergänzungstabelle dargestellt). 1). Zellen in der stationären Phase variierten in der RSG-Fluoreszenzintensität in allen Kulturen (Erweiterte Daten, Abb. 2a), was auf eine physiologische Heterogenität hindeutet, die mit früheren Studien übereinstimmt 12, 13, unterschieden sich jedoch von den Negativkontrollen (Erweiterte Daten, Abb. 2b). Die durchschnittliche Fluoreszenz pro Zelle korrelierte mit der durchschnittlichen Rate des Sauerstoffverbrauchs pro Zelle innerhalb des analysierten Bereichs (etwa 1–1.000 amol O2 pro Zelle und Stunde, R2 = 0,86), ohne Hinweise auf taxonomische Verzerrungen (Abb. 1a). Diese Kulturkalibrierung ermöglichte die Verwendung der RSG-Fluoreszenzintensität als Proxy für die Atmungsfrequenz einer einzelnen Zelle.

a, Vergleich der normalisierten RSG-Fluoreszenzintensität mit zellspezifischen O2-Verbrauchsraten in Laborkulturen. Jeder Punkt stellt ein Kulturexperiment (n = 50) dar, wobei die Fluoreszenzwerte auf Fluoreszenzkügelchenstandards normalisiert sind, die zur Interkalibrierung des Instruments verwendet werden. Weitere experimentelle Details finden Sie in der Ergänzungstabelle 1. b, Vergleich der Atmungsraten von marinem Prokaryoplankton, ermittelt mit Winkler- und zellspezifischen RSG-Methoden (n = 12). Für die RSG-Methode wurde die durchschnittliche Atmungsfrequenz pro Zelle aus der Atmungsfrequenz pro Zelle berechnet und dann zur Berechnung der Gesamtmenge an verbrauchtem O2 zusammen mit der Anzahl der RSG-markierten Zellen pro ml verwendet. In beiden Diagrammen stellt der dunkler schattierte Bereich das 95 %-Konfidenzintervall und der heller schattierte Bereich das vorhergesagte 95 %-Intervall um die Regressionslinie dar.

Um die Verwendung von RSG zur Quantifizierung der Atmung in Umweltstudien zu validieren, führten wir gleichzeitig Einzelzell-RSG-Sondierungen und Massenatmungsmessungen unter Verwendung der traditionellen Winkler-Methode14 an geografisch unterschiedlichen Prokaryoplanktonproben unter In-situ-Bedingungen durch. Zellspezifische O2-Verbrauchsraten wurden mithilfe der Kulturkalibrierung berechnet (Abb. 1a) und zur Schätzung der Massenverbrauchsraten verwendet. Beide Techniken ergaben ähnliche Schätzungen des O2-Verbrauchs im gesamten analysierten Bereich von 0,008–2,3 µmol O2 pro l und h (Abb. 1b). Dies lieferte einen weiteren Beweis dafür, dass RSG als Proxy für mikrobielle Sauerstoffatmungsraten in einem Umweltkontext verwendet werden kann. Anhand verschiedener abgetöteter Kontrollproben wurde festgestellt, dass die zellspezifische analytische Nachweisschwelle in Umweltproben bei etwa 4 amol O2 pro Zelle und Stunde liegt (Extended Data Abb. 3a,b). Die niedrigste Zellhäufigkeit, die wir mithilfe unserer Durchflusszytometrieanalyse quantifizieren konnten, lag bei etwa 106 Zellen pro Liter (Lit. 15). Dies führt zu einer theoretischen Nachweisgrenze von RSG-basierten Messungen der mikrobiellen Gemeinschaftsatmung von etwa 4 pmol O2 pro l und Stunde, was etwa vier Größenordnungen niedriger ist als die standardmäßigen O2-Verbrauchstests mit Winkler- oder Optodensensorerkennung14. Somit kann der RSG-Ansatz Messungen der mikrobiellen Atmung in Umgebungen mit geringer Biomasse und/oder geringer Aktivität ermöglichen, in denen es den aktuellen Methoden an Empfindlichkeit mangelt. Darüber hinaus dauert die RSG-Untersuchung nur wenige Minuten, was die zeitliche Auflösung der Messung erhöht und das Risiko von Flascheneffekten im Vergleich zu den typischerweise ≥24 Stunden dauernden Inkubationen für Winkler-Messungen4 verringert. Wichtig ist, dass dieser Ansatz die Atmung auf einzigartige Weise bei der Auflösung einzelner Zellen und auf zerstörungsfreie Weise misst, was Möglichkeiten bietet, die Variabilität der interzellulären Atmung zu untersuchen und sie mit anderen Analysen derselben Zellen zu kombinieren.

Um die Atmungsraten zwischen Prokaryoplanktonlinien zu vergleichen und diese Messungen mit dem Genominhalt und der Zellgröße der Linien in Beziehung zu setzen, führten wir RSG-Untersuchungen und anschließende Einzelzellgenomik an sechs marinen Prokaryoplanktonproben durch, die aus dem Küstengolf von Maine (GoM; 43,86° N) entnommen wurden , 69,58° W) über einen Zeitraum von zwei Jahren (Ergänzungstabelle 2). Einzelne amplifizierte Genome (SAGs) wurden mit zuvor beschriebenen Techniken16 erzeugt und sequenziert, wobei zusätzlich RSG als Fluoreszenzquelle bei der Zellsortierung durch Durchflusszytometrie verwendet wurde, bei der die optischen Eigenschaften jeder Zelle aufgezeichnet wurden. Anschließend wurde die Lichtstreuintensität im Vorwärtswinkel verwendet, um den Durchmesser jeder Zelle abzuschätzen16. Die zellspezifische RSG-Fluoreszenz in drei dieser Proben, die im Oktober 2018, April 2019 und Juli 2019 gesammelt wurden, wurde mithilfe der oben beschriebenen Kulturkalibrierung in Atemfrequenzen umgerechnet. Aufgrund von Änderungen in der Gerätekonfiguration wurden die drei früheren Proben, die 2017 gesammelt wurden, auf ähnliche Weise analysiert, jedoch ohne die quantitative Umrechnung der RSG-Fluoreszenz in Atemfrequenzen.

Wir haben einen ähnlichen Anteil an Genomen aus einzelnen Zellen gewonnen, die entweder mit RSG oder dem häufig verwendeten Nukleinsäurefarbstoff SYTO-9 untersucht wurden, was die Kompatibilität von RSG mit der nachgeschalteten Einzelzell-DNA-Amplifikation und -Sequenzierung demonstriert (Extended Data, Abb. 3c). Die RSG-basierten Schätzungen der Massenatmungsraten lagen im Bereich von 0,35–0,78 µmol O2 pro l und h, was mit früheren Messungen im GoM17 und anderen Küstenumgebungen18 übereinstimmt. Die geschätzten Atmungsraten einzelner Zellen erstreckten sich über fünf Größenordnungen, von unterhalb der Nachweisgrenze (<0,004 fmol O2 pro Zelle und Stunde) bis etwa 145 fmol O2 pro Zelle und Stunde (Abb. 2a, erweiterte Daten, Abb. 4 und Ergänzungstabelle 3). ). Obwohl selbst bei Zellen mit nahezu identischen Genomen erhebliche Unterschiede in der Atmungsfrequenz auftraten, wiesen Zellen mit einer vorhergesagten durchschnittlichen Aminosäureidentität von über etwa 60 % gleichmäßigere Atmungsfrequenzen auf als Zellen mit größerer Genomdivergenz, was in etwa der Grenze zwischen heutigen Gattungen entsprach Prokaryoten-Taxonomie (Abb. 2b). Um unseren Datensatz auf biologisch sinnvolle Weise zu vereinfachen, haben wir SAGs auf Gattungsebene geclustert.

a, Die phylogenetische Zusammensetzung, Atmungsraten und Durchmesser einzelner Prokaryoplanktonzellen, die im Oktober 2018 gesammelt wurden. Dargestellt ist der Maximum-Likelihood-Baum des 16S-rRNA-Gens, das in Archaea verwurzelt ist. Bootstrap-Werte über 0,75 werden durch schwarze Kreise angezeigt. Gattungen sind durch graue und weiße Schattierungen getrennt. Die Namen der in diesem Artikel behandelten Gattungen werden angezeigt. Referenzeinträge von kultivierten Isolaten sind mit einem roten Sternchen gekennzeichnet. b, Die Beziehung zwischen der Aminosäureidentität und dem Verhältnis des O2-Verbrauchs in Zellpaaren, die aus derselben Probe gewonnen wurden. Die schwarze Linie zeigt das mittlere O2-Verbrauchsverhältnis in 1 %-Intervallen an und der grau schattierte Bereich wird durch das 10 %-Quantil unten und das 90 %-Quantil oben begrenzt. c, Gattungsspezifische Zellhäufigkeit auf Basis der metagenomischen Read-Rekrutierung. d, Gattungsspezifische Atmungsraten pro Zelle. Die Box- und Whisker-Diagramme zeigen den Median (Mittellinie), das erste und dritte Quartil (Boxgrenzen) und den 1,5-fachen Interquartilbereich (Whisker). Die Punkte zeigen Ausreißer außerhalb des 1,5-fachen Interquartilbereichs an. e, Der Anteil der Prokaryoplanktonatmung, der von jeder Gattung durchgeführt wird. In c–e sind die zehn häufigsten Gattungen und zehn Gattungen mit dem größten Beitrag zur Gemeinschaftsatmung enthalten. Die vertikalen grauen Linien trennen die Gattungen. Die Farben in c–e sind wie in a definiert. Beachten Sie, dass die gattungsspezifischen Atmungsschätzungen Zellen berücksichtigen, die unter die RSG-Nachweisgrenze fallen, wie in den Methoden beschrieben. Für c–e ist das Probenahmedatum oben links in c angegeben und die Anzahl der sortierten und sequenzierten Zellen pro Tag betrug n = 282 (30. Oktober 2018), n = 274 (2. April 2019) und n = 277 (9). Juli 2019).

Unsere Ergebnisse zeigten erhebliche Unterschiede in den zellspezifischen Atmungsraten und Beiträgen zum Sauerstoffverbrauch des Prokaryoplanktons zwischen den Gattungen (Abb. 2c – e). Am oberen Ende des Spektrums enthielten die Gattungen ASP10-02a (Gammaproteobacteria), LFER01 und Planktomarina (beide Mitglieder der Roseobacter-Klade, Rhodobacteraceae, Alphaproteobacteria) Zellen, die mehr als 1 fmol O2 pro Zelle und Stunde atmeten. Planktomarina trug zu allen drei Zeitpunkten 10–37 % zum gesamten O2-Verbrauch bei, während sie nur 1,2–2,5 % der Zellen ausmachte. Zellen mit mittleren Atmungsraten von 0,01–1 fmol O2 pro Zelle und Stunde wurden von Amylibacter (Roseobacter-Klade), mehreren Gattungen von Bacteroidia, der Gattung Gammaproteobacteria Thioglobus und mehreren weniger häufig vorkommenden Gattungen dominiert (Extended Data Abb. 5). Am unteren Ende des Spektrums enthielten 99 der 303 identifizierten Gattungen keine Zellen, die unsere Nachweisgrenze von etwa 0,004 fmol O2 pro Zelle und Stunde überstiegen. Bemerkenswerterweise enthielten drei der fünf am weitesten verbreiteten Gattungen zu keinem Zeitpunkt Zellen, die mehr als 0,03 fmol O2 pro Zelle und Stunde atmeten: die Alphaproteobakterien-Gattung Pelagibacter und zwei Gattungen des Gammaproteobakterien-Clusters SAR86 (AAA076-P13 und D2472). Pelagibacter und SAR86 machten zu den Zeitpunkten zusammen 22–24 % aller Zellen aus, während sie nur 0,6–5,6 % der gesamten Prokaryoplanktonatmung ausmachten. Die RSG-basierte Schätzung des durchschnittlichen O2-Verbrauchs von Pelagibacterin GoM (etwa 5,0 amol O2 pro Zelle und Stunde) ähnelte früheren Messungen in einer Kultur in der stationären Phase (etwa 1–10 amol O2 pro Zelle und Stunde)19. In ähnlicher Weise wurde berichtet, dass die Roseobacter-Klade und ASP10-02a unter den aktivsten Prokaryoplanktonzellen in Algenblüten und Küstenumgebungen überrepräsentiert sind20,21,22. Somit stimmen unsere Ergebnisse im Allgemeinen mit früheren Studien überein, was darauf hindeutet, dass RSG-basierte Einzelzellanalysen eine realistische Einschätzung der Unterschiede in den Atmungsraten zwischen Prokaryoplankton-Taxa bieten.

Bei der Betrachtung der drei Experimente, in denen die zellspezifische Atmung quantifiziert wurde, wurden die stärksten saisonalen Unterschiede bei der Gammaproteobakterien-Gattung ASP10-02a und verschiedenen Gattungen von Flavobacteriaceae (Bacteroidia) beobachtet (Abb. 2c, d). Diese Gattungen hatten im April 2019 die höchsten zellspezifischen Atmungsraten und Zellhäufigkeiten. In ähnlicher Weise hatten Flavobacteriaceae und ASP10-02a in den nicht kalibrierten Experimenten von 2017 im April eine erhöhte RSG-Fluoreszenz und relative Zellhäufigkeit im Vergleich zu August und November ( Erweiterte Daten Abb. 6). Obwohl diese Studie eine begrenzte zeitliche Auflösung aufweist, ist es bemerkenswert, dass die beiden April-Experimente während oder kurz nach der Frühlingsalgenblüte in GoM stattfanden (Extended Data, Abb. 3d). Unsere Ergebnisse stimmen mit früheren Berichten überein, wonach sowohl Flavobacteriaceae23,24,25,26 als auch ASP10-02a21 mit Algenblüten in Zusammenhang stehen. Bemerkenswert ist, dass die meisten anderen Prokaryoplankton-Gattungen trotz der großen saisonalen Unterschiede in der Temperatur und der Primärproduktivität in GoM27 keine ausgeprägten Unterschiede in den zellspezifischen Atmungsraten zwischen den Probenahmedaten aufwiesen.

Wir führten ähnliche Einzelzellatmungs- und Genomanalysen von Proben aus geografisch unterschiedlichen Offshore-Standorten im Atlantik und Pazifischen Ozean durch (Ergänzungstabelle 2). Im Durchschnitt hatten Mikroorganismen aus diesen oligotrophen Umgebungen niedrigere Atmungsraten pro Zelle als Prokaryoplankton aus der GoM. Ähnlich wie GoM hatten viele der am häufigsten vorkommenden Abstammungslinien, darunter Pelagibacter und SAR86, extrem niedrige Atmungsraten (<10 amol O2 pro Zelle und Stunde), während der Großteil des O2-Verbrauchs auf Gattungen mit geringer Häufigkeit zurückzuführen war (Extended Data Abb . 7 und 8). Zusammengenommen deuten diese und GoM-Ergebnisse auf eine allgemeine Entkopplung von Atmungsraten und Zellhäufigkeit bei marinen Prokaryoplankton-Taxa hin.

Mit Ausnahme von Cyanobakterien wird allgemein angenommen, dass die mit der Sauerstoffatmung gekoppelte Heterotrophie die vorherrschende Energiequelle für Prokaryoplankton an der Meeresoberfläche ist. Daher ist unsere Feststellung, dass einige der am häufigsten vorkommenden Prokaryoplankton-Linien, insbesondere Pelagibacter und SAR86, extrem niedrige zellspezifische In-situ-Respirationsraten aufweisen, rätselhaft. Dies wirft die Frage auf, wie diese Mikroorganismen zahlenmäßig die Vorherrschaft behalten und nicht von Gattungen mit rund 100-fach höheren zellspezifischen In-situ-Respirationsraten wie Planktomarina und ASP10-02a verdrängt werden, und wie diese Ergebnisse mit früheren Berichten über relativ hohe Werte in Einklang gebracht werden können In-situ-Raten der Zellverdoppelung, Proteinsynthese und Substrataufnahme durch Pelagibacter28.

Unser Befund einer konstant niedrigen Atmungsrate bei allen analysierten Pelagibacter- und SAR86-Zellen über alle Probenentnahmedaten und -orte hinweg (Abb. 2 und erweiterte Daten Abb. 4, 7, 8 und 10) widerspricht früheren Hypothesen über ein grassierendes Wachstum einiger Pelagibacter-Ökotypen sind genau auf die örtlichen Gegebenheiten abgestimmt29. Die geringe Zellgröße kann teilweise eine Erklärung für ihre minimale Atmung sein. Zellen der Gattungen Pelagibacter, AAA076-P13 und D2472 hatten einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 0,3 µm, wohingegen der Durchmesser von Planktomarina, Amylibacter, LFER01 und ASP10-02a durchschnittlich 0,5–0,8 µm betrug (Ergänzungstabelle 4). Unter der Annahme einer ähnlichen Zellform führt ein zweifacher Unterschied im Durchmesser zu einem achtfachen Unterschied im Biovolumen. Dies ist erheblich, aber nicht ausreichend, um die viel größeren Unterschiede in den zellspezifischen Atmungsraten zu erklären. Darüber hinaus beobachteten wir nur eine schwache Korrelation zwischen dem Volumen einer Zelle und der Atemfrequenz (Abb. 3a). Stattdessen korrelierten die RSG-basierten Atmungsraten stärker mit der vom Genom vorhergesagten minimalen Verdopplungszeit30 (Abb. 3b), was darauf hindeutet, dass die Wachstumsraten vieler Gattungen in den analysierten GoM-Proben nahe an ihrem theoretischen Maximum lagen. Interessanterweise fanden wir keine Korrelation zwischen der Atmung und der Häufigkeit von Zellen, die virale DNA enthalten, zwischen den Gattungen, noch Unterschiede in den SAR86-Atmungsraten zwischen Daten mit hohem (Oktober 2018) und niedrigem (Juli 2019) Anteil virushaltiger Zellen (Extended Data Abb. 3e), was dagegen spricht, dass Phagen-Wirt-Wechselwirkungen einen großen Einfluss auf die zellspezifischen Prokaryoplankton-Atmungsraten haben.

a, Gewichtete durchschnittliche O2-Verbrauchsrate im Verhältnis zum Biovolumen. b, Gewichtete durchschnittliche O2-Verbrauchsrate im Vergleich zur minimalen Verdopplungszeit. c, Biovolumen im Vergleich zur Anzahl der 16S-rRNA-Gentranskripte. d, Gewichtete durchschnittliche O2-Verbrauchsrate im Vergleich zur Anzahl der 16S-rRNA-Gentranskripte. e, Gewichtete durchschnittliche O2-Verbrauchsrate im Vergleich zur Anzahl der mRNA-Transkripte. Für a–d stellt jeder Datenpunkt einen Durchschnittswert dar, der für jede Gattung und Feldprobe berechnet wurde. Die durchgezogenen Linien zeigen Regressionen und die gepunkteten Linien zeigen Medianwerte an. Beachten Sie, dass die gewichteten O2-Verbrauchsraten Zellen berücksichtigen, die unter die RSG-Nachweisgrenze fallen, wie in den Methoden beschrieben.

Um zusätzliche Einblicke in die Physiologie des GoM-Prokaryoplanktons zu gewinnen, haben wir aus vier der analysierten Proben quantitative metatranskriptomische Datensätze31 generiert. Einzelne Lesevorgänge wurden mit GoM-SAGs als Referenzdatenbank3 kommentiert und auf Transkripte pro Zelle normalisiert. Die durchschnittliche Gesamtzahl der mRNA- und 16S-rRNA-Gentranskripte pro Zelle betrug 36 bzw. 426, was den früheren Berichten über Küsten-Prokaryoplankton ähnelt32. Unsere Studie zeigte jedoch, dass diese Zahlen zwischen den Prokaryoplanktongattungen stark schwankten und bei mRNA zwischen 5 und 144 pro Zelle und bei rRNA zwischen 48 und 2.480 pro Zelle lagen. Wir beobachteten eine Korrelation zwischen der Zellgröße und der Kopienzahl des rRNA-Transkripts (Abb. 3c), es gab jedoch keine signifikante Korrelation zwischen den zellspezifischen Atmungsraten und der Anzahl der rRNA- oder mRNA-Moleküle (Abb. 3d, e), die manchmal verwendet werden als Stellvertreter für die Stoffwechselaktivität33,34. Darüber hinaus waren die rRNA-Zahlen pro Biovolumen zwischen den Gattungen relativ einheitlich und unterschieden sich zwischen Pelagibacter und Planktomarina nur um das Dreifache. Dies deutet darauf hin, dass die Anzahl der ribosomalen und gesamten mRNA-Moleküle schlechte Indikatoren für die Zellatmung sind und dass andere energieerzeugende Prozesse als die Atmung für den Stoffwechsel von GoM-Prokaryoplankton wichtig sein könnten.

Die auf Proteorhodopsin basierende Phototrophie ist eine ergänzende Quelle der ATP-Synthese , deren Kodierungspotential im marinen Prokaryoplankton , einschließlich der meisten GoM-Gattungen, weit verbreitet ist (Ergänzungstabelle 4). Daher können einige Prokaryoplankton-Abstammungslinien Mixotrophe sein, die auf einer Kombination aus heterotrophen und phototrophen Prozessen als Energiequellen beruhen. Eine kürzlich durchgeführte Studie zur Pigmentverteilung im Mittelmeer ergab, dass Proteorhodopsin eine ähnliche Menge an Sonnenenergie einfängt wie Chlorophyll a, was möglicherweise ausreicht, um den Grundstoffwechsel einer durchschnittlichen Prokaryoplanktonzelle aufrechtzuerhalten36. Obwohl bekannt ist, dass Pelagibacter und andere vorherrschende Gruppen des Prokaryoplanktons an der Meeresoberfläche einfache organische Verbindungen20,28,37 verbrauchen, kann der Zugang zu aus Proteorhodopsin gewonnenem ATP die Verwendung dieser Moleküle in der Biosynthese im Gegensatz zur Atmung erhöhen und somit die Wachstumseffizienz steigern19,38 ,39. Es fehlen jedoch direkte Beweise für die Bedeutung von Proteorhodopsin für die zelluläre Energetik des Prokaryoplanktons in situ und für die biogeochemischen Prozesse des Ozeans5,6. Hier stellten wir fest, dass die Anzahl der Proteorhodopsin-Transkripte pro Zelle trotz ihrer geringen Zellgröße zu den höchsten in Taxa mit einigen der niedrigsten nachweisbaren Atmungsraten gehörte, einschließlich Pelagibacter und SAR86 (Abb. 4a). Angesichts der extremen Rationalisierung der Genomen und des Metabolismus von Pelagibacter und SAR8637 ist die Fülle an Proteorhodopsin-Transkripten ein starker Hinweis auf die Bedeutung der Phototrophie für diese vorherrschenden Prokaryoplankton-Linien.

a, Die Beziehung zwischen den zellspezifischen Atmungsraten und dem Proteorhodopsin-Transkript zählt zu den Gattungen. Jeder Datenpunkt repräsentiert eine Gattung und eine einzelne Feldstichprobe. Farben und Formen sind wie in Abb. 3 definiert. b, Schematische Darstellung der komplementären Rolle von Atmung und Proteorhodopsin-Phototrophie bei der Erzeugung von Protonengradienten und ATP im Prokaryoplankton. c,d, Zellgrößen, Atmungsraten und taxonomische Zugehörigkeiten einzelner Prokaryoplanktonzellen, die im August 2021 in GoM nachts (c) und tagsüber (d) gesammelt wurden. Beachten Sie, dass die gattungsspezifischen Atmungsschätzungen Zellen berücksichtigen, die unter die RSG-Nachweisgrenze fallen, wie in den Methoden beschrieben.

Frühere Studien haben einen unterschiedlichen Metabolismus von Prokaryoplankton zwischen Tag und Nacht gezeigt, einschließlich eines Tageszyklus der Genexpression für Transporter40 und Proteorhodopsine41. Alle oben beschriebenen RSG-Experimente wurden am Vormittag durchgeführt, wenn die Proteorhodopsin-Transkriptzahlen möglicherweise am höchsten sind41. Um den möglichen Einfluss der Proteorhodopsin-Phototrophie auf die Atmungsfrequenz zu untersuchen, führten wir im August 2021 tagsüber und nachts zusätzliche RSG-Sondierungs- und Einzelzellgenomikexperimente an GoM-Prokaryoplankton durch Die Photosynthese erhöht die Verfügbarkeit labiler organischer Substrate. Im Gegensatz dazu ist zu erwarten, dass nicht-cyanobakterielle prokaryotische Phototrophen nachts mehr atmen, um das Fehlen der Proteorhodopsin-gesteuerten Protonenpumpe auszugleichen (Abb. 4b). In Übereinstimmung mit dem ersten Szenario wies die Gattung UBA10364 (Bacteroidota, Flavobacteria) tagsüber höhere Atemfrequenzen auf als nachts (Abb. 4c, d, Erweiterte Daten Abb. 9 und 10). Im Gegensatz dazu waren die Atemfrequenzen von AA076-P13 (SAR86) nachts sechsmal höher (52 gegenüber 8 amol O2 pro Zelle und Stunde) als tagsüber (Mann-Whitney-U-Test, P < 0,05; Erweiterte Daten, Abb. 9). und 10), was auf einen möglichen Effekt der Phototrophie auf den Energiestoffwechsel dieser Gattung schließen lässt. Es wurde zuvor gezeigt, dass SAR86-Linien über einen vielfältigen Satz von Proteorhodopsin-Genen verfügen42,43, die sie möglicherweise zur Ergänzung der durch die Atmung erzeugten Energie nutzen. Die Verringerung der AA076-P13-Atmung am Tag um 44 amol O2 pro Zelle und Stunde impliziert, dass möglicherweise eine vergleichbare Menge an ATP unter Verwendung des Proteorhodopsin-gesteuerten Protonengradienten erzeugt wurde. Allerdings war die Atmung von Pelagibacter tagsüber und nachts ähnlich und lag bei etwa 5 amol O2 pro Zelle und Stunde. In unserem Experiment könnten mehrere Faktoren den vollständigen Einfluss der Proteorhodopsin-Phototrophie auf die Energiequellen des Prokaryoplanktons verdeckt haben, darunter (1) die Stimulation der Atmung durch Photosyntheseprodukte während des Tages; (2) eine eingeschränkte Fähigkeit einiger Gattungen, ihren Stoffwechsel zu regulieren, einschließlich Pelagibacter37; (3) variable Wachstumseffizienz; und (4) unzureichende statistische Aussagekraft aufgrund des geringen Umfangs dieses Experiments. Durch die spekulative Annahme, dass die gemeinschaftsweite durchschnittliche Wirkung von Proteorhodopsin-betriebenen Protonenpumpen 44 amol O2 pro Zelle und Stunde für 12 ha am Tag entspricht, können wir abschätzen, dass GoM-Prokaryoplankton Proteorhodopsine verwendet, um das ATP zu erzeugen, das dem erzeugten ATP entspricht ab 0,5 µmol O2 pro l und Tag, eine Größenordnung weniger als die gesamte Prokaryoplanktonatmung. Es wird erwartet, dass die Bedeutung der Proteorhodopsin-Phototrophie in oligotrophen Offshore-Umgebungen viel größer ist38, in denen Atmungsraten von weniger als 10 amol O2 pro Zelle und Stunde für die meisten Prokaryoplanktonzellen (Extended Data Abb. 7 und 8) und Proteorhodopsin typisch sind kann eine mit Chlorophyll a36 vergleichbare Menge Sonnenlicht absorbieren. In produktiven Regionen kann der relativ konstante Zugang zu aus Proteorhodopsin gewonnenem ATP die Auswirkungen saisonaler Unterschiede in der Phytoplanktonproduktivität auf das Prokaryoplankton abschwächen und zur Erklärung der begrenzten Saisonalität in der GoM-Prokaryoplanktonzusammensetzung beitragen (Abb. 2c – e und erweiterte Daten Abb. 4).

Integrierte Genom- und Phänotypanalysen einzelner, nicht kultivierter Zellen ergaben, dass sich die zellspezifischen Atmungsraten zwischen marinen Prokaryoplankton-Gattungen um mehr als das Tausendfache unterscheiden. Wir fanden heraus, dass, obwohl der Großteil der Atmung von relativ seltenen Abstammungslinien durchgeführt wird, die am häufigsten vorkommenden Prokaryoplankton-Taxa extrem niedrige Atmungsraten aufweisen, was die Quelle ihres Wettbewerbsvorteils in Frage stellt. Die Entkopplung von Atmungsraten und Abstammungshäufigkeit, die erhöhte Anzahl von Proteorhodopsin-Transkripten in Zellen mit geringer Atmung und die erhöhte Atmung einiger der Taxa mit geringer Atmung in der Nacht deuten gemeinsam darauf hin, dass eine auf Proteorhodopsin basierende Phototrophie die Wachstumseffizienz und Produktivität der vorherrschenden Zellen steigern kann Prokaryoplanktongruppen, indem sie entweder Energie für die Aufnahme von Nährstoffen bereitstellen oder die Biosynthese von Biomolekülen vorantreiben, was wiederum Auswirkungen auf den Kohlenstoff- und Energiefluss im Oberflächenozean hat.

Nach Angaben des Herstellers (Thermo Fisher Scientific) wandeln Oxidoreduktasen RSG in lebenden Zellen in ein grün fluoreszierendes Produkt um, das mithilfe von Mikroskopie oder Durchflusszytometrie quantifiziert werden kann. Im Vergleich zu einer funktionell ähnlichen und zuvor verwendeten Tetrazoliumsonde CTC44 weist RSG überlegene spektrale Fluoreszenzeigenschaften, eine kürzere Inkubationszeit und keine bekannten toxischen Wirkungen auf11. Das Handbuch zum BacLight RedoxSensor Green Vitality Kit (Thermo Fisher Scientific) empfiehlt eine 10-minütige Probeninkubation mit RSG, bevor mit der Zellanalyse fortgefahren wird. Um den Einfluss der Inkubationsdauer auf die Häufigkeit und Fluoreszenzintensität mariner Prokaryoplanktonzellen zu testen, führten wir am 11. August 2016 einen Test mit Meerwasser durch, das von der Küsten-GoM (43,8609° N, 69,5782° W) gesammelt wurde sterile 50-ml-Polypropylenröhrchen und zur weiteren Verarbeitung bei In-situ-Temperatur ins Labor transportiert. Diese Proben wurden mit der vom Hersteller empfohlenen RSG-Konzentration (1 µM Endkonzentration) ergänzt und bei In-situ-Temperatur im Dunkeln für eine variable Zeitspanne inkubiert, bevor sie mit dem BD Influx Mariner Durchflusszytometer (Becton Dickinson, ehemals Cytopeia) analysiert wurden mit einem 488-nm-Laser zur Anregung und einer 70-μm-Düsenöffnung. RSG-positive Zellen wurden auf der Grundlage der grünen Partikelfluoreszenz (531/40-Bandpass), der Vorwärtsstreuung und des Verhältnisses von grüner zu roter Fluoreszenz (692/40-Bandpass; zur verbesserten Unterscheidung von Zellen von Detritalpartikeln) ausgewählt. Wir fanden heraus, dass sowohl die Häufigkeit als auch die Fluoreszenzintensität RSG-positiver Zellen ihre Maximalwerte erreichten und nach 30–70 Minuten Inkubation stabil blieben (Extended Data, Abb. 3f). Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurden nachfolgende RSG-Inkubationen für 30 Minuten angesetzt.

Isolate phänotypisch unterschiedlicher Arten, Shewanella loihica45, Roseobacter denitrificans46, Pseudomonas stutzeri47, Ruegeria pomeroyi48 und Vibrio alginolyticus49, wurden vom National Center for Marine Algae and Microbiota erworben. Isolate von Rhodoluna lacicola50 und Oligotropha carboxidovorans51 wurden aus der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen bezogen. Die Kulturen wurden in spezifischen Medien bei unterschiedlichen Temperaturen und Nährstoffkonzentrationen (Mediumrezepte und Wachstumsbedingungen sind in der Ergänzungstabelle 1 angegeben) in 70-ml-Serumfläschchen aus Glas, verschlossen mit Butylgummistopfen, mit atmosphärischer Luft im Kopfraum (Ausgangs-O2-Konzentration 21 %) gezüchtet ein rotierender Schütteltisch, um einen vollständigen Gasaustausch zwischen dem Kulturmedium und dem Kopfraum des Gefäßes zu ermöglichen. Aufgrund der Notwendigkeit, kleine Flüssigkeitsmengen zu bestimmten Zeitpunkten zu entnehmen, wurde ein Headspace-Ansatz verwendet.

Die Sauerstoffkonzentration in allen Kulturgefäßen wurde mit dem optischen Messgerät Firesting-O2 nach Herstellerangaben (PyroScience-Sensortechnologie) gemessen. Für jede Serumflasche wurde die Optodensonde in den Kopfraum eingeführt, wobei die Temperaturnormalisierungssonde auch in einen anderen Kopfraum der Flasche (mit Meerwasser in der flüssigen Phase) eingeführt wurde, der auf der gleichen Temperatur wie die zu analysierende Kultur gehalten wurde. Die Sauerstoffkonzentration wurde im Kopfraum gemessen und in die Konzentration gelösten Sauerstoffs im Kulturmedium umgerechnet, wobei ein vollständiges Gasgleichgewicht zwischen dem Kulturmedium und dem Kopfraum der Kultur vorausgesetzt wurde (da alle Kulturen auf einem rotierenden Schütteltisch gehalten wurden) und Temperatur und Kopfraum berücksichtigt wurden Druck und Salzgehalt des Kulturmediums52. Diese Umwandlung war aufgrund der Firesting-O2-Optodenmethode möglich, bei der O2 direkt an der Spitze der Optodensonde gemessen wird (d. h. es gibt bei dieser Methode keine Diffusion oder keinen Verbrauch von O2). Nach der Messung von O2 im Kopfraum wurde die im Kulturmedium vorhandene Konzentration mithilfe der Kopfraum-Äquilibrierungstechnik berechnet53 und unter Verwendung der Bunsen-Koeffizienten54,55 für O2 berechnet, die Temperatur und Salzgehalt bei konstantem Atmosphärendruck auf Meereshöhe berücksichtigen. Die O2-Konzentrationen im Kulturmedium wurden alle paar Stunden auf der Grundlage der geschätzten Verdopplungszeit jedes Kulturtyps gemessen. Messungen der O2-Konzentration für jede Kultur erstreckten sich über die anfängliche Inokulation über die logarithmische Wachstumsphase bis zum Erreichen der stationären Phase. Betriebsbedingte Veränderungen der mikrobiellen Zellhäufigkeit wurden anhand von Messungen der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm mit einem Spektrophotometer bestimmt. Es wurde festgestellt, dass sich eine Kultur in der stationären Phase befand, sobald die O2-Konzentration nicht mehr exponentiell abnahm und die Zellhäufigkeit nicht mehr exponentiell zunahm. Während der stationären Phase wurden die O2-Atmungsraten als zeitnormalisierte Unterschiede der O2-Konzentration zwischen den Messungen berechnet. Um die O2-Atmungsraten pro durchschnittlicher Zelle abzuschätzen, wurde die Häufigkeit mikrobieller Zellen durch Durchflusszytometrieanalyse von Teilproben des Kulturmaterials bestimmt, die gleichzeitig mit der Messung der O2-Konzentrationen entnommen wurden, wie unten beschrieben.

Nachdem die Kulturen die stationäre Phase erreicht hatten, wurden 1-ml-Unterproben mit einer sterilen Nadel und Spritze entnommen, in ein 2-ml-Kryoröhrchen überführt und mit 1 µl RSG-Stammlösung ergänzt. Nach vorsichtigem Mischen wurden die Kryoröhrchen 30 Minuten lang bei der gleichen Temperatur wie ihre Ausgangskulturen inkubiert. Die Kryoröhrchen wurden dann mit 5 % Glycerin und 1× pH 8 Tris-EDTA-Puffer (Endkonzentrationen) ergänzt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur späteren Verwendung in der Durchflusszytometrie-Analyse bei –80 °C gelagert. Nachdem RSG-inkubierte Proben entnommen wurden und sich die Kultur noch in der stationären Phase befand, wurden abgetötete Kontrollen für jeden Kulturtyp hergestellt, indem 10 ml Kultur und Medium 30 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert wurden. Es wurden auch Proben von nicht beimpftem Medium und abgetöteten Kontrollen entnommen, um geeignete Gates für die nachgeschaltete Durchflusszytometrieanalyse zu bestimmen.

Nach dem Auftauen wurden die kryokonservierten Proben mit dem Durchflusszytometer ZE5 Cell Analyzer (Bio-Rad) analysiert. Die Proben wurden mit blauer Anregung (488 nm) analysiert und das Instrument wurde mithilfe eines 525/35-nm-Bandpassfilters sowohl auf Vorwärtsstreuung als auch auf grüne Fluoreszenz getriggert. Das Analysetor wurde auf der Grundlage der Partikelgrünfluoreszenz (RSG) und der rechtwinkligen Seitenstreuung definiert. Die Analysetore wurden so eingestellt, dass Bereiche eliminiert wurden, die nur nichtzelluläres Partikelrauschen von nicht beimpften Medienrohlingen enthielten, und auch Bereiche eliminiert wurden, die tote Zellen enthielten (durch Autoklavieren abgetötet). Für alle Kulturproben war ein Bereich wachsender Zellen klar definiert (Extended Data Abb. 2b). Zellhäufigkeit und grüne Fluoreszenz wurden in FlowJo v.10.6.2 (Becton Dickinson) analysiert.

Um die tägliche Drift und die Unterschiede zwischen den Zytometrieinstrumenten und -einstellungen des ZE5 Cell Analyzer-Durchflusszytometers (Bio-Rad) und des BD Influx Mariner-Durchflusszytometers (Becton Dickinson, ehemals Cytopeia) zu berücksichtigen, wurde ein Verfahren zur Normalisierung des Zellgrüns entwickelt Fluoreszenz unter Verwendung eines von zwei Standardkits für fluoreszierende Partikelgrößen: NFPPS-52-4K oder RCP-30-5A (Spherotech). Diese Perlen wurden jeden Tag mittels Durchflusszytometrie analysiert, wenn RSG-markierte Zellen analysiert wurden, wobei dasselbe Instrument und dieselben Einstellungen verwendet wurden. Für jede Perle wurde das geometrische Mittel der 525/35-Fluoreszenz mit FlowJo berechnet. Für das NFPPS-52-4K-Bead-Kit wurde dem am wenigsten fluoreszierenden Bead ein normalisierter Fluoreszenzwert von 1 zugewiesen und die normalisierten Fluoreszenzwerte der anderen Beads (Ergänzungstabelle 5) wurden als durchschnittliches Verhältnis ihrer Fluoreszenz relativ zu berechnet Fluoreszenz der am wenigsten fluoreszierenden Perle. Die Durchschnittswerte dieser Verhältnisse wurden aus der Anwendung dieser Technik an mehreren Tagen geschätzt.

Für jeden Tag der Analyse von Feld- und Kulturproben wurde eine lineare Regression durchgeführt, um die Beziehung zwischen der gemessenen Fluoreszenz der Kügelchen und ihren normalisierten Fluoreszenzwerten festzustellen. Dann wurde die normalisierte Fluoreszenz jeder Zelle wie folgt geschätzt:

Dabei ist x die gemessene Fluoreszenz einer Zelle, m die experimentell bestimmte Steigung der linearen Regression der Perle ab dem Tag der Zellanalyse und b der experimentell bestimmte Achsenabschnitt der linearen Regression der Perle ab dem Tag der Zellanalyse.

Um die beiden Perlensätze miteinander zu kalibrieren, wurden sie an mehreren Tagen auf dem BD Influx Mariner-Durchflusszytometer einer durchflusszytometrischen Co-Analyse unterzogen und die normalisierte Fluoreszenz des geometrischen Mittelwerts jeder RCP-30-5A-Perle wurde unter Verwendung der oben beschriebenen linearen Regressionsgleichung berechnet. Ein standardisierter normalisierter Fluoreszenzwert wurde durch Mittelung des geometrischen Mittels der RCP-30-5A-Perlen aus mehreren Tagen berechnet (Ergänzungstabelle 5 (Spalte RCP-30-5A)). Die standardisierte normalisierte Fluoreszenz der RCP-30-5A-Perlen wurde verwendet, um eine lineare Regressionsanalyse durchzuführen, um die Beziehung zwischen der gemessenen Fluoreszenz der Perlen und ihrer normalisierten Fluoreszenz (siehe oben) an Tagen zu ermitteln, an denen die NFPPS-52-4K-Perlen nicht vorhanden waren verfügbar.

Anschließend korrelierten wir die normalisierte Fluoreszenz mikrobieller Kulturen mit ihrer durchschnittlichen Atemfrequenz (Abb. 1a), was zu der folgenden exponentiellen Beziehung führte:

Dabei ist die Zellatmung die zellspezifische Atmungsschätzung in fmol O2 pro Zelle und Stunde und die normalisierte Fluoreszenz die normalisierte RSG-Fluoreszenz der Zelle (siehe oben). Diese Gleichung wurde zur einfacheren Interpretation in Abb. 1a umgewandelt.

Um die Verwendung von RSG zur Quantifizierung der Atmung zu validieren, führten wir gleichzeitige RSG-Sonden- und Massenatmungsmessungen unter Verwendung der traditionellen Winkler-Methode14 an geografisch unterschiedlichen Prokaryoplanktonproben an der Küste und im offenen Ozean unter In-situ-Bedingungen durch (Ergänzungstabelle 2). Für GoM-Proben wurde Meerwasser in einer Tiefe von 1 m mit einer Niskin-Flasche am gleichen Ort wie die oben beschriebenen RSG-Proben gesammelt, mit Ausnahme einer Probe (Damariscotta River), deren Ort in der Ergänzungstabelle 2 angegeben ist. Das Meerwasser wurde gesammelt, durch einen 40-µm-Maschenfilter geleitet und zum Befüllen von acht Flaschen mit biologischem Sauerstoffbedarf (BSB) ohne Kopfraum verwendet. Jeder Kolben wurde mit mindestens dem Dreifachen seines Volumens überströmt, um Luftblasen zu vermeiden und jeden zusätzlichen Gasaustausch des Wassers mit der Atmosphäre während der Überführung in den Behälter zu verhindern. Vier dieser Flaschen wurden sofort fixiert56, während die restlichen vier Flaschen vor der Fixierung 24 Stunden lang bei In-situ-Temperatur im Dunkeln inkubiert wurden56. Die Sauerstoffkonzentration in allen Flaschen wurde mit einem amperometrischen Titrator56 analysiert.

Proben aus dem offenen Meer wurden direkt aus den Niskin-Flaschen in BSB-Flaschen gesammelt, während Proben aus dem Mittelmeerküstengebiet mit Eimern vom Ufer gesammelt und in mit Säure gereinigte Polycarbonat-Ballonflaschen überführt wurden. Im Labor angekommen wurde das küstennahe Mittelmeerwasser durch 0,8 µm Polycarbonatfilter gefiltert und in BSB-Flaschen überführt. Jeder Kolben wurde um mindestens das Dreifache seines Volumens überfüllt. Die drei replizierten BSB-Flaschen wurden sofort fixiert und drei weitere Flaschen wurden 24 Stunden lang im Dunkeln bei In-situ-Temperatur inkubiert. Nach der Fixierung mit den Winkler-Chemikalien wurden die Proben mit der potentiometrischen Methode56 (Küstenmittelmeer und Nordatlantik) oder der Spektrophotometrie57 (Süd- und Äquatorialatlantik) gemessen. Die Winkler-basierten Prokaryoplankton-Atmungsraten wurden als Unterschied in der Konzentration gelösten Sauerstoffs zwischen Anfangs- und Endprobe geschätzt.

Unmittelbar nach der Entnahme der Feldprobe wurden Teilproben 30 Minuten lang bei In-situ-Temperatur im Dunkeln mit RSG inkubiert und dann bis zur Durchflusszytometrieanalyse und Schätzung der zellspezifischen Atmungsraten wie oben beschrieben bei –80 ° C gelagert. Die RSG-basierten Massenatmungsraten wurden durch Multiplizieren der durchschnittlichen zellspezifischen Atmungsraten (oben beschrieben) mit der Häufigkeit atmender Zellen in jeder Probe erhalten.

Für die Hauptstudie wurden an sechs Tagen von April 2017 bis Juli Proben aus der GoM am Dock des Bigelow Laboratory for Ocean Sciences am Ufer von East Boothbay an der Mündung des Damariscotta River (43,8609° N, 69,5782° W) gesammelt 2019 (Ergänzungstabelle 2). Wasserproben wurden aus einer Tiefe von 1 m mit einer 5-l-Niskin-Flasche gesammelt, durch einen 50-µm-Maschenfilter geleitet, in mit Säure gewaschene Polycarbonatflaschen überführt, bei In-situ-Temperatur ins Labor transportiert und sofort verarbeitet. Proben aus dem offenen Meer wurden mit an einer CTD-Rosette befestigten 12-l-Niskin-Flaschen gesammelt und in mit Säure gewaschene Polycarbonatflaschen überführt. Anschließend wurden doppelte 1-ml-Meerwasser-Unterproben in Kryoröhrchen überführt, mit 1 µl RSG (1 µM Endkonzentration) ergänzt, 30 Minuten lang im Dunkeln bei In-situ-Temperatur inkubiert und mit 5 % Glycerin und 1 × TRIS-EDTA-Puffer, pH 8, ergänzt (Endkonzentrationen), in flüssigem N2 schockgefroren und bei −80 °C gelagert. In allen Fällen wurden zusätzliche 1-ml-Meerwasser-Unterproben mit 5 % Glycerin und 1 × TRIS-EDTA-Puffer pH 8 (Endkonzentrationen) ergänzt, in flüssigem N2 schockgefroren und ohne RSG-Zugabe bei –80 °C gelagert.

Um die Tag- und Nachtbedingungen zu vergleichen, wurden am 24. (14:00 EST) und 25. (02:00 EST) August 2021 zusätzliche GoM-Meerwasserproben vom Dock des Bigelow Laboratory nach den gleichen Verfahren wie oben beschrieben entnommen. 1-ml-Probenaliquots verdreifachen wurden mit RSG markiert und wie oben beschrieben kryokonserviert.

Zur Sortierung der atmenden Zellen verwendeten wir Proben, die im Feld mit RSG markiert wurden, wie oben beschrieben. Zur unspezifischen Sortierung von Prokaryoplanktonzellen wurden die kryokonservierten und aufgetauten Meerwasserproben mit der SYTO 9-Nukleinsäurefärbung (5 µM Endkonzentration; Thermo Fisher Scientific) 10–60 Minuten auf Eis inkubiert. Die durchflusszytometrische Analyse und Sortierung wurde mit einem BD InFlux Mariner-Durchflusszytometer durchgeführt, das mit einem 488-nm-Laser zur Anregung und einer 70-μm-Düsenöffnung (Becton Dickinson, früher Cytopeia) ausgestattet war. Das Zytometer wurde in den meisten Fällen durch Vorwärtsstreuung und im August 2021 durch grüne Fluoreszenz ausgelöst. Für maximale Sortierreinheit wurde der Modus „Einzel-1-Tropfen“ verwendet. Das Sortiertor wurde basierend auf der grünen Fluoreszenz der Partikel (Proxy für Nukleinsäuregehalt oder Atmungsrate), Vorwärtsstreuung (Proxy für Zelldurchmesser) und dem Verhältnis von grüner zu roter Fluoreszenz (für eine verbesserte Unterscheidung von Zellen von Detritalpartikeln) definiert. Die Zellen wurden in Mikroplatten mit 384 Vertiefungen, die 600 nl 1 × TE-Puffer pro Vertiefung enthielten, abgelegt und bis zur weiteren Verarbeitung bei –80 ° C gelagert. Von den 384 Vertiefungen waren 317 Vertiefungen für einzelne Zellen bestimmt, 64 Vertiefungen dienten als Negativkontrollen (keine Tröpfchenablagerung) und 3 Vertiefungen enthielten jeweils 10 Zellen als Positivkontrollen. Die Genauigkeit der Tröpfchenablagerung in Mikrotiterplattenvertiefungen wurde an jedem Sortiertag mehrmals bestätigt, indem SPHERO Rainbow Fluorescent Particles (Spherotech) mit einem Durchmesser von 3,46 µm sortiert und ihr Vorhandensein am Boden jeder Vertiefung mittels Mikroskopie untersucht wurden. Bei diesen Untersuchungen enthielten weniger als 2 % der Vertiefungen keine Kügelchen und <0,4 % der Vertiefungen enthielten mehr als ein Kügelchen.

Indexsortierungsdaten wurden mit der BD Sortware-Software erfasst. Die folgenden Laborkulturen wurden bei der Entwicklung einer äquivalenten Zelldurchmesser-Kalibrierungskurve verwendet: Prochlorococcus marinus CCMP 2389; Mikrobakterium sp.; Pelagibacter ubique HTCC1062; und Synechococcus CCMP 2515. Die durchschnittlichen Zelldurchmesser dieser Kulturen wurden mit dem Multisizer 4e Coulter Counter (Beckman Coulter) bestimmt. Die durchschnittliche Vorwärtsstreuung jeder der vier Kulturen wurde unter Verwendung derselben Durchflusszytometrieeinstellungen bestimmt, die bei der Sortierung von Umweltproben verwendet wurden, und an jedem Tag der Einzelzellsortierung wiederholt. Wir beobachteten eine starke Korrelation zwischen Zelldurchmessern und Vorwärtsstreuung (FSC) bei diesen Kulturen16. Unter Ausnutzung dieser Korrelation wurde der geschätzte Durchmesser der sortierten Umweltzellen (Durchmesser in µm) anhand eines logarithmisch-linearen Regressionsmodells geschätzt:

wobei a und b empirisch abgeleitete Regressionskoeffizienten für jeden Tag der Sortierung16 sind und FSC die gemessene Vorwärtsstreuung ist. Diese Berechnung wurde für alle Zellsortierungssitzungen der Durchflusszytometrie wiederholt. Das Proxy-Zellenvolumen wurde unter der Annahme einer Kugelform für alle Abstammungslinien berechnet.

Vor der Amplifikation genomischer DNA wurden die Zellen lysiert und ihre DNA durch zwei Einfrier-Auftau-Zyklen und die Zugabe von 700 nl eines Lysepuffers, bestehend aus 0,4 M KOH, 10 mM EDTA und 100 mM Dithiothreitol, und eine anschließende 10-minütige Inkubation bei … denaturiert 20 °C. Die Lyse wurde durch Zugabe von 700 nl 1 M Tris-HCl, pH 4, beendet. Die Amplifikation des gesamten Genoms einzelner Zellen wurde unter Verwendung von WGA-X16 durchgeführt. Kurz gesagt, die 10 µl WGA-X-Reaktionen enthielten Endkonzentrationen von 0,2 U µl−1 Equiphi29-Polymerase (Thermo Fisher Scientific), 1× Equiphi29-Reaktionspuffer (Thermo Fisher Scientific), jeweils 0,4 µM dNTP (New England BioLabs), 10 µM Dithiothreitol (Thermo Fisher Scientific), 40 µM zufällige Heptamere mit zwei 3′-terminalen phosphorthioierten Nukleotidbindungen (Integrated DNA Technologies) und 1 µM SYTO 9 (Thermo Fisher Scientific). Diese Reaktionen wurden 12–16 Stunden lang bei 45 °C durchgeführt und dann durch eine 15-minütige Inkubation bei 75 °C inaktiviert. Um zu verhindern, dass WGA-X-Reaktionen mit Nicht-Ziel-DNA kontaminiert werden, wurden alle Zelllyse- und DNA-Amplifikationsreagenzien mit ultraviolettem Licht in einem Stratalinker (Stratagene)58-System behandelt. Eine empirische Optimierung der UV-Bestrahlung wurde durchgeführt, um die Dauer der UV-Bestrahlung zu bestimmen, die erforderlich ist, um alle nachweisbaren Verunreinigungen zu vernetzen, ohne die Reaktion zu inaktivieren. Zellsortierung, Lyse und WGA-X-Einrichtung wurden in einer HEPA-gefilterten Umgebung gemäß den Reinraumspezifikationen der Klasse 1000 durchgeführt. Vor der Zellsortierung wurden das Instrument, die Reagenzien und der Arbeitsbereich mithilfe von UV-Bestrahlung und Natriumhypochloritlösung auf DNA dekontaminiert59. Um das Risiko einer DNA-Kontamination weiter zu reduzieren und die Genauigkeit und den Durchsatz zu verbessern, wurden die Roboter-Flüssigkeitshandhaber Bravo (Agilent Technologies) und Freedom Evo (Tecan) für die gesamte Flüssigkeitshandhabung in 384-Well-Platten verwendet.

Bibliotheken für die SAG-Genomsequenzierung wurden mit Nextera XT (Illumina)-Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers erstellt, mit Ausnahme der Reinigungsschritte, die mit Säulenreinigungskits (QIAGEN) durchgeführt wurden, und der Auswahl der Bibliotheksgröße, die mit BluePippin (Sage Science) durchgeführt wurde ) mit einer Zielgröße von 500 ± 50 bp. DNA-Konzentrationsmessungen wurden mit Quant-iT dsDNA Assay Kits (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Bibliotheken wurden entweder mit dem NextSeq 500-System (Illumina) im 2 × 150-bp-Modus oder dem NextSeq 2000-System (Illumina) im 2 × 100-bp-Modus sequenziert. Die erhaltenen Sequenzablesungen wurden mit Trimmomatic (v.0.32)60 unter Verwendung der folgenden Einstellungen qualitätsgetrimmt: -phred33 LEADING:0 TRAILING:5 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36. Lesevorgänge, die mit der Homo sapiens-Referenzanordnung GRCh38 und einer lokalen Datenbank von WGA-X-Reagenzkontaminanten16 (≥95 % Identität von ≥100 bp-Alignments) übereinstimmen, sowie Lesevorgänge mit geringer Komplexität (die <5 % aller Nukleotide enthalten) wurden entfernt. Die verbleibenden Lesevorgänge wurden mit kmernorm v.1.05 (http://sourceforge.net/projects/kmernorm) unter Verwendung der Einstellungen -k 21 -t 30 -c 3 digital normalisiert und dann mit SPAdes (v.3.0.0)61 unter Verwendung zusammengesetzt die folgenden Einstellungen: --careful --sc --phred-offset 33. Jedes Ende der erhaltenen Contigs wurde um 100 bp gekürzt und nur Contigs, die länger als 2.000 bp waren, wurden beibehalten. Contigs, die mit der H. sapiens-Referenzanordnung GRCh38 und einer lokalen Datenbank von WGA-X-Reagenzkontaminanten16 (≥95 % Identität von ≥100 bp-Alignments) übereinstimmen, wurden entfernt. Die Qualität der resultierenden Genomassemblierungen wurde mithilfe von CheckM (v.1.0.7)62 und Tetramer-Frequenzanalyse63 bestimmt. Dieser Arbeitsablauf wurde anhand von drei bakteriellen Benchmark-Kulturen mit unterschiedlicher Genomkomplexität und unterschiedlichem GC-Prozentsatz auf Assemblierungsfehler untersucht. Dies ergab, dass in den Assemblies keine Nichtziel- und undefinierten Basen vorhanden waren und die folgenden durchschnittlichen Häufigkeiten von Fehlassemblierungen, Indels und Fehlpaarungen pro 100 kb auftraten: 1,5, 3,0 und 5,0 bzw. (Ref. 16). Die 153 SAGs, in denen potenziell kontaminierende DNA-Sequenzen nachgewiesen wurden, wurden aus dem Datensatz entfernt. Dies führte zu 7.518 kuratierten SAG-Genomassemblierungen.

Die paarweise durchschnittliche SAG-Aminosäureidentität wurde mit CompareM64 geschätzt. Die 16S-rRNA-Genregionen, die länger als 500 bp sind, wurden mithilfe lokaler Alignments identifiziert, die von BLAST mit der von CREST65 kuratierten SILVA-Referenzdatenbank SILVAMod (v.128)66 bereitgestellt wurden, und mithilfe einer Neuimplementierung des CREST-Algorithmus für den letzten gemeinsamen Vorfahren klassifiziert. Phylogenetische Bäume wurden aus nahezu vollständigen (>1.400 bp) SAG 16S-rRNA-Genen generiert, indem zunächst Alignments mit dem SINA-Aligner (v.1.2.11)67 erstellt und dann phylogenetische Beziehungen mit maximaler Wahrscheinlichkeit in MEGACC (v.10.2.4) abgeleitet wurden. 68 mit 100 Bootstraps. Die Bäume wurden in iTOL69 mit Anmerkungen versehen und visualisiert. Taxonomische Zuordnungen von SAGs wurden mit GTDB-Tk (v.1.4.1)70 erhalten.

Die funktionale Annotation wurde zunächst mit Prokka71 mit den von der Software bereitgestellten Standard-Swiss-Prot-Datenbanken durchgeführt. Prokka wurde ein zweites Mal mit einer benutzerdefinierten Protein-Annotationsdatenbank ausgeführt, die aus der Zusammenstellung von Swiss-Prot72-Einträgen für Archaeen und Bakterien erstellt wurde. Taxonomische Zuordnungen wurden mit GTDB-Tk (v.1.4.1)70 erhalten. Virussequenzen (ganze oder teilweise Contigs) wurden unabhängig voneinander mithilfe von drei bereits vorhandenen bioinformatischen Virusidentifizierungstools identifiziert: ViruScope73 (virus_prob > 0,95), VirSorter274 (nur Kategorie 1 und 2) und DeepVirFinder75 (P > 0,95). Die Ergebnisse dieser drei Tools wurden kombiniert. Falsch-positive Ergebnisse (P < 0,95) wurden mit CheckV76 entfernt.

Mikrobielle Biomasse aus 100–200 ml Meerwasser-Aliquots wurde auf sterilisierten Supor 0,2 µm-Filtern (Pall Corporation) durch Vakuumfiltration (maximaler Druck von 15 psi) gesammelt, dann in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Nukleinsäureextraktion bei –80 °C gelagert . MTST5- und MTST6-RNA-Standards wurden jedem Filter vor der RNA-Extraktion bis zu einer geschätzten Konzentration von 0,1–1 % Gesamtausbeute zugesetzt, wie zuvor beschrieben31. DNA und RNA wurden parallel mit dem Zymobiomics DNA/RNA Miniprep Kit (Zymo Research) extrahiert und bis zur weiteren Verarbeitung bei –80 °C gelagert. RNA-Proben wurden mit dem RNA Clean & Concentrator Kit (Zymo Research) weiter gereinigt und konzentriert. cDNA-Bibliotheken für die Illumina-Shotgun-Sequenzierung wurden mit KAPA RNA HyperPrep (Roche Sequencing) erstellt. Bibliotheken für die DNA-Shotgun-Sequenzierung wurden mit dem Nextera XT-Kit (Illumina) gemäß den Anweisungen des Herstellers erstellt. Die Größe beider Bibliothekstypen wurde mit BluePippin (Sage Science) auf 370 bp „eng“ eingestellt und mit der Tapestation (Agillent) quantifiziert. Diese Bibliotheken wurden mit dem NextSeq 500-System (Illumina) im 2 × 150-bp-Modus sequenziert.

Nach der Sequenzierung wurden Lesevorgänge aus RNA- und DNA-Bibliotheken zunächst mit Trimmomatic gekürzt (Einstellungen: -phred33 LEADING:0 TRAILING:5 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:75). Lesevorgänge, die mit der H. sapiens-Referenzanordnung GRCh38 und einer lokalen Datenbank von WGA-X-Reagenzkontaminanten16 übereinstimmen (≥95 % Identität von ≥100-bp-Alignments), sowie Lesevorgänge mit geringer Komplexität (die <5 % aller Nukleotide enthalten) wurden entfernt. Die verbleibenden Lesevorgänge wurden mit bbmerge unter Verwendung der folgenden Einstellungen zusammengeführt: k = 40, extension2 = 60, iterations = 5, lose='t', qtrim2='t'. Die zusammengeführten Lesevorgänge wurden mit dem Kaiju-Klassifikator77 taxonomisch und funktionell annotiert, nachdem die zugrunde liegende Referenzgenomdatenbank wie zuvor beschrieben durch SAGs aus dieser Studie ersetzt wurde3. Um SSU-rRNA-Gentranskripte zu identifizieren, wurden metatranskriptomische Lesevorgänge auf der SILVA SSU-Bibliothek66 (v.132) unter Verwendung von Bowtie278 mit 95 % Identität über die Länge des Lesevorgangs abgebildet. Die Häufigkeit jeder Gattung in einer Probe (GAi; Zellen pro ml) wurde wie folgt berechnet:

wobei e ein Normalisierungsfaktor für Gattungen ist, die keine SAGs erzeugt haben, und wie folgt definiert ist:

Dabei ist ai die Anzahl der Metagenom-Reads, die für SAG der Gattung i rekrutiert wurden, bi der durchschnittliche Anteil an Nukleotiden in SAG-Anordnungen der Gattung i, die Proteine ​​kodieren, c die Gesamtzahl der Reads im Metagenom und di die durchschnittliche geschätzte Genomgröße der Gattung i SAG und f ist die Gesamthäufigkeit von Prokaryoplankton in Zellen pro ml. Diese Berechnung wurde für jeden Probenahmetag wiederholt.

Die durchschnittliche Anzahl der Transkripte pro Zelle (TCi) wurde für jede Gattung und jedes Gen wie folgt berechnet:

Dabei ist ai die Anzahl der auf dem Gen von Interesse kartierten Lesevorgänge, b die Anzahl der der Probe hinzugefügten MTST5- und MTST6-RNA-Transkripte, c die Anzahl der auf MTST5 und MTST6 kartierten Lesevorgänge und somit ist das Verhältnis b/c die Anzahl der Transkripte pro Lesevorgang, d ist das Volumen der auf dem Filter gesammelten Probe in ml und GAi ist die Gattungshäufigkeit (Zellen pro ml; siehe oben). Diese Berechnung wurde für jeden Probenahmetag wiederholt.

Die durchschnittliche Zellatmungsrate (ACRi; amol O2 pro Zelle pro Stunde) jeder Gattung in jeder GoM-Meerwasserprobe wurde wie folgt geschätzt:

wobei R definiert ist als:

Dabei ist ai die durchschnittliche Atmungsrate der in SAGs gewonnenen Zellen einer bestimmten Gattung, deren geschätzte Atmungsraten die Nachweisgrenze überschreiten (4 amol O2 pro Zelle pro Stunde), bi ist die Anzahl der SAGs, die als zur Gattung i gehörend klassifiziert sind (d. h. die Anzahl der aktiven Zellen in der Gattung i), c ist die Anzahl aller RSG-SAGs (auch bekannt als die Anzahl der sequenzierten aktiven Zellen in der Probe), also ist bi/c der Anteil der aktiven Zellen in der Gattung i, d ist die Gesamtzahl Konzentration aktiver Zellen mit einer geschätzten Atmungsrate über der Nachweisgrenze (Zellen pro ml; Ergänzungstabelle 2) und z ist gleich der minimal erfassten zellspezifischen Atmungsrate in Amol O2 pro Zelle und Stunde.

Die Menge R ist die Anzahl aktiver Zellen der Gattung i pro ml. Die Größe 0,5 × z[GAi − R] ist ein Korrekturfaktor für die Zellen unterhalb der Nachweisgrenze. Aufgrund der unterschiedlichen Empfindlichkeiten der Messmethoden konnte es vorkommen, dass R gelegentlich etwas größer als GAi war. Als dies geschah, wurde R gleich GAi gesetzt, sodass GAi − R = 0 war. Diese Berechnung wurde für jeden Probenahmetag wiederholt. Diese Berechnung wurde nur für die Gattungen und Proben durchgeführt, für die mindestens 3 RSG-markierte SAGs identifiziert wurden.

Für die Messung der wichtigsten Nährstoffkonzentrationen wurden 100-ml-Unterproben GoM-Meerwasser aus denselben Proben entnommen, die auch für Einzelzell-Genomik- und Atmungsanalysen verwendet wurden. Diese Proben wurden sofort durch eine Nucleopore Track-Edge-Membran mit 25 mm und 0,4 µm Porengröße (Whatman) filtriert und bis zur Analyse von NO3−, NO2−, NH4+ und PO43− auf einem SEAL AA3 (Seal) bei –80 °C gelagert Analytical Limited). Darüber hinaus wurden von jeder Feldprobe dreifache Meerwasser-Unterproben zu je 100 ml entnommen und innerhalb von 2 Stunden auf Glasmikrofaserfiltern (Whatman, GF/F) vakuumfiltriert. Jeder GF/F-Filter wurde 24–48 Stunden lang in 10 ml 90 % Aceton bei –20 °C extrahiert. Die Extrakte wurden auf dem 10-AU-Fluorometer (Turner Designs) vor und nach der Zugabe von 50 µl 10 % HCl analysiert und die Konzentrationen von Chlorophyll und Phaeophytin wurden wie zuvor beschrieben79 bestimmt

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Metagenom- und Metatranskriptom-Reads sowie Einzelzell-Genomassemblierungen >100 kb sind unter NCBI BioProject PRJNA846736 verfügbar. Alle Metagenom- und Metatranskriptom-Reads sowie Einzelzell-Genomassemblys, einschließlich der 603 Genomassemblys <100 kb, sind im Open Science Framework (https://osf.io/r2un6) verfügbar.

Alle Analysen wurden mit Open-Access-Software durchgeführt. Benutzerdefinierte Skripte zum Kombinieren von Ergebnissen und Generieren von Bildern sind auf Anfrage erhältlich.

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Wir danken B. Thompson, C. Mascena und B. Tupper vom Single Cell Genomics Center des Bigelow Laboratory for Ocean Sciences für die Erstellung von Einzelzell-Genomdaten; MA Moran, C. Smith und B. Nowinski für ihre Hilfe beim Aufbau eines quantitativen Transkriptomik-Workflows; MA Moran und S. Giovannoni für ihre Kommentare zum Manuskript; den Kapitänen und Besatzungen der R/V Sarmiento de Gamboa, R/V Ramon Margalef und R/V Atlantis für ihre Unterstützung auf See; K. Ziervogel, K. Dykens und D. Moser für ihre Unterstützung bei der Probenentnahme während AT42-11 an Bord der R/V Atlantis; C. González-Pola und JM Arrieta für die Möglichkeit, an ihren Kreuzfahrten teilzunehmen. Das INOCEN-Labor (IEO, PI M. Álvarez) war für die Sauerstoffanalyse in RADPROF 2018 verantwortlich. R. Santiago und A. Massanet für ihre Hilfe bei der chemischen Analyse von Mallorca-Proben. Meerwasserproben aus der GoM wurden am Dock des Bigelow Laboratory in East Boothbay gesammelt und erforderten keine Genehmigung. Mit Zustimmung der kanadischen Regierung wurden Meerwasserproben von AT42-11 entnommen. Diese Arbeit wurde durch Auszeichnungen der US National Science Foundation (1826734 für RS, DE, BNO und NJP; 1737017 für BNO und 1335810 für RS), des Österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF)-Projekts ARTEMIS (P28781-B21 für GJH) und unterstützt durch das Stipendium der Simons Foundation (827839 an RS).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Jacob H. Munson-McGee, Melody R. Lindsay

Bigelow Laboratory for Ocean Sciences, East Boothbay, ME, USA

Jacob H. Munson-McGee, Melody R. Lindsay, Julia M. Brown, Timothy D'Angelo, Joe Brown, Laura C. Lubelczyk, David Emerson, Beth N. Orcutt, Nicole J. Poulton und Ramunas Stepanauskas

Abteilung für Funktionelle und Evolutionäre Ökologie, Universität Wien, Wien, Österreich

Eva Sintes & Gerhard J. Herndl

Instituto Español de Oceanografía-CSIC, Centro Oceanográfica de Baleares, Palma, Spanien

Eva Sintes

Purdue University, West Lafayette, IN, USA

Paxton Tomko

Abteilung für Marine Mikrobiologie und Biogeochemie, Königliches Niederländisches Institut für Meeresforschung (NIOZ), Universität Utrecht, Den Burg, Niederlande

Gerhard J. Herndl

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RS, BNO, NJP, DE und GJH konzipierten die Studie und stellten die Finanzierung sicher. MRL, TD und ES pflegten Kulturen und maßen die Atmung. JHM-M., MRL, ES, TD, LCL, NJP und RS sammelten die Proben und generierten die Daten. JHM-M., MRL, JMB, TD, JB und PT analysierten die Daten. JHM-M., MRL, NJP und RS haben das Papier unter Mitwirkung aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Ramunas Stepanauskas.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature dankt Damien Eveillard und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Über einen Zeitraum von der Inokulation bis zur stationären Phase wurde die Sauerstoffkonzentration in versiegelten Flaschen gemessen, die kultivierte Isolate aquatischer Mikroorganismen enthielten. Teilproben dieser Inkubationen wurden mit RSG untersucht, wonach die Zellfluoreszenz und -häufigkeit mittels Durchflusszytometrie gemessen wurden. Eine Kalibrierungskurve wurde entwickelt, indem die durchschnittliche Zellfluoreszenzintensität mit dem Sauerstoffverbrauch verglichen wurde, der für die Zellhäufigkeit in jeder Kultur normalisiert wurde.

A. Diversität der RSG-Fluoreszenz zwischen Zellen in kultivierten Isolatinkubationen. B. Setzen von Toren RSG-positiver Zellen in Streudiagrammen der Lichtseitenstreuung (x-Achse) und der grünen Fluoreszenz (y-Achse) einzelner Zellen. Jede Kultur wurde einzeln kontrolliert, basierend auf einer abgetöteten Kontrollprobe dieser Kultur.

AB. Durchflusszytometrisches Gating von RSG-markiertem Prokaryoplankton. Die GoM-Meerwasserprobe wurde am 2. April 2019 entnommen und vor (A) oder nach (B) einer Wärmebehandlung mit RSG gekennzeichnet. Dargestellt sind die ersten 100.000 Ereignisse in beiden Stichproben (die meisten Ereignisse liegen auf der Basislinie). C. Vollständigkeit der Genomassemblierung aller SAGs des Golfs von Maine, die entweder mit RSG (blau, n = 2.572) oder SYTO-9 (orange, n = 1.632) untersucht wurden. Die Kästchen geben Mittelwerte, das erste und dritte Quartil sowie Whiskers an, die bis zu 1,5 Interquartilbereiche umfassen. D. Chlorophyll-Konzentration in der Nähe von Boothbay Harbor (43,84° N, 69,64° W). Vertikale schwarze Linien zeigen Tage an, an denen Proben für SAG-Analysen gesammelt wurden. E. Zusammenhang zwischen Atemfrequenz und dem Vorhandensein von Virus-DNA in einzelnen Zellen. Jeder Datenpunkt repräsentiert eine Gattung in einer einzelnen Feldstichprobe. F. Optimierung der RSG-Inkubationslänge für marines Prokaryoplankton. Angegeben sind die Häufigkeit und Fluoreszenzintensität von RSG-positiven Zellen in zwei Replikatproben.

A. SAGs vom 2. April 2019. B. SAGs vom 9. Juli 2019. In beiden Bäumen sind kultivierte Isolate als phylogenetische Referenzen enthalten und durch rote Schriftfarbe gekennzeichnet. Die Bäume wurzelten im archaischen Zweig, sofern vorhanden, und in der Mitte, wenn keine Archaeen enthalten waren.

Die Zellen sind nach taxonomischen Klassen gefärbt, die durch Einzelzellgenomsequenzierung bestimmt wurden.

Große Punkte stellen Zellen dar, die für die Einzelzellgenomik sortiert wurden. Farblich hervorgehoben sind Abstammungslinien mit ausgeprägten Unterschieden in der Atmungsfrequenz zwischen den Probenahmedaten. Aufgrund von Änderungen in der Konfiguration des Durchflusszytometers konnten wir die Atemfrequenzen in den drei Proben aus dem Jahr 2017 nicht schätzen.

A. Zellen aus einer Probe, die am 9. März 2019 im südlichen Atlantik (32,35 S, 44,02 W) gesammelt wurde. B. Zellen aus einer Probe, die am 22. August 2018 im nördlichen Atlantik (43,00 N, 11,33 W) gesammelt wurde. In der Mitte waren Bäume verwurzelt. Bootstrap-Werte >0,75 werden durch schwarze Kreise angezeigt.

A. Zellen aus einer Probe, die am 23. Mai 2019 im nordöstlichen Pazifischen Ozean (47,76 N, 127,76 E) gesammelt wurde. B. Zellen aus einer Probe, die am 20. März 2019 im äquatorialen Atlantik (3,10 N, 29,01 W) gesammelt wurde. Bäume wurzeln im archaischen Ast, wenn dieser vorhanden ist, und in der Mitte, wenn der archaische Ast fehlt. Bootstrap-Werte >0,75 werden durch schwarze Kreise angezeigt.

A. Lichtvorwärtsstreuung und RSG-Fluoreszenz von tagsüber gesammelten Zellen. B. Lichtvorwärtsstreuung und RSG-Fluoreszenz von Zellen, die während der Nacht gesammelt wurden. Die Bezeichnung „R1“ gibt die Position von Zellen mit mittleren Atmungsraten an, die nachts im Vergleich zum Tag häufiger vorkommen. Die Beschriftung „R2“ gibt die Positionen von Zellen mit hohen Atmungsraten an. C. Gattungsspezifische Atemfrequenzen tagsüber (gelb, n = 190) und nachts (blau, n = 190). Dargestellt sind Gattungen, aus denen mindestens drei RSG-positive Zellen sequenziert wurden. Rote Schrift kennzeichnet Gattungen mit einem statistisch signifikanten Unterschied in den Atemfrequenzen zwischen Tag und Nacht (zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test, mindestens 4 Zellen pro Zeitpunkt, AAA076-P13-p-Wert = 0,010, UBA10364-p-Wert = 0,038). . Die Kästchen geben den Median, das erste und dritte Quartil sowie Whiskers an, die bis zum 1,5-fachen des Interquartilbereichs (IQR) reichen. Werte über oder unter 1,5 IQR werden als Kreise dargestellt.

A. Zellen aus einer Probe, die am 24. August 2021 um 14:00 Uhr entnommen wurde. B. Zellen aus einer Probe, die am 25. August 2021 um 02:00 Uhr entnommen wurde. Bootstrap-Werte > 0,75 werden durch schwarze Kreise angezeigt. Bäume wurzeln im archaischen Ast, wenn dieser vorhanden ist, und in der Mitte, wenn der archaische Ast fehlt.

Mikrobielle Isolate und Kultivierungsbedingungen, die bei der RSG-Fluoreszenzkalibrierung verwendet werden (Ergänzungstabelle 1); Feldproben-Metadaten (Ergänzungstabelle 2); Merkmale einzelner SAGs (Ergänzungstabelle 3); Merkmale der SAG-Gattungen (Ergänzungstabelle 4); und normalisierte Fluoreszenzintensität für die Perlenkits NFPPS-52-4K und RCP-30-5A (Spherotech, Lake Forest, IL) (Ergänzungstabelle 5).

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 14. Februar 2022

Angenommen: 01. November 2022

Veröffentlicht: 07. Dezember 2022

Ausgabedatum: 22. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05505-3

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