Nitazoxanid hemmt acetyliertes KLF5

BMC Medicine Band 21, Artikelnummer: 68 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Kastrationsresistenter Prostatakrebs metastasiert oft in den Knochen, und solche Knochenmetastasen werden schließlich resistent gegen verfügbare Therapien, was zum Tod der Patienten führt. TGF-β ist im Knochen angereichert und spielt eine zentrale Rolle bei der Entwicklung von Knochenmetastasen. Für die Behandlung von Knochenmetastasen war es jedoch eine Herausforderung, TGF-β oder seine Rezeptoren direkt anzugreifen. Wir haben zuvor herausgefunden, dass TGF-β die Acetylierung des Transkriptionsfaktors KLF5 an K369 induziert und dann von dieser abhängt, um mehrere biologische Prozesse zu regulieren, einschließlich der Induktion von EMT, zellulärer Invasivität und Knochenmetastasierung. Acetyliertes KLF5 (Ac-KLF5) und seine nachgeschalteten Effektoren sind daher potenzielle therapeutische Ziele für die Behandlung von TGF-β-induzierter Knochenmetastasierung bei Prostatakrebs.

Ein Sphäroid-Invasionstest wurde auf Prostatakrebszellen angewendet, die KLF5K369Q exprimieren, das Ac-KLF5 nachahmt, um 1987 von der FDA zugelassene Medikamente auf Invasionsunterdrückung zu testen. Luciferase- und KLF5K369Q-exprimierende Zellen wurden Nacktmäusen über die Schwanzarterie injiziert, um Knochenmetastasen zu modellieren. Biolumineszenz-Bildgebung, Mikro-CT und histologische Analysen wurden zur Überwachung und Bewertung von Knochenmetastasen eingesetzt. RNA-Sequenzierung, bioinformatische und biochemische Analysen wurden verwendet, um durch Nitazoxanid (NTZ) regulierte Gene, Signalwege und die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen. Die Bindung von NTZ an KLF5-Proteine ​​wurde mithilfe von Fluoreszenztitration, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Zirkulardichroismusanalyse (CD) bewertet.

NTZ, ein Anthelminthikum, wurde in den Screening- und Validierungstests als wirksamer Invasionshemmer identifiziert. Bei KLF5K369Q-induzierter Knochenmetastasierung übte NTZ eine starke Hemmwirkung im präventiven und therapeutischen Bereich aus. NTZ hemmte auch die Osteoklastendifferenzierung, einen zellulären Prozess, der für die durch KLF5K369Q induzierte Knochenmetastasierung verantwortlich ist. NTZ schwächte die Funktion von KLF5K369Q bei der Hochregulierung von 127 Genen und der Herunterregulierung von 114 Genen ab. Die Expressionsänderungen einiger Gene waren signifikant mit einem schlechteren Gesamtüberleben bei Patienten mit Prostatakrebs verbunden. Eine dieser Veränderungen war die Hochregulierung von MYBL2, das die Knochenmetastasierung bei Prostatakrebs funktionell fördert. Zusätzliche Analysen zeigten, dass NTZ an das KLF5-Protein band, KLF5K369Q an den Promotor von MYBL2, um dessen Transkription zu aktivieren, und dass NTZ die Bindung von KLF5K369Q an den MYBL2-Promotor abschwächte.

NTZ ist ein potenzielles Therapeutikum für Knochenmetastasen, die durch die TGF-β/Ac-KLF5-Signalachse bei Prostatakrebs und wahrscheinlich auch anderen Krebsarten induziert werden.

Peer-Review-Berichte

Prostatakrebs (PCa) ist eine der häufigsten Ursachen für krebsbedingte Mortalität bei Männern [1]. Im Anfangsstadium von PCa können lokalisierte Tumoren erfolgreich durch eine Operation oder Strahlentherapie behandelt werden, allerdings erleiden etwa 20–30 % der Patienten einen Rückfall [2]. Obwohl rezidivierte Patienten in der Regel anfänglich empfindlich auf eine Androgendeprivationstherapie reagieren, entwickeln sie schließlich einen kastrationsresistenten Prostatakrebs (CRPC) [3]. Die meisten CRPCs metastasieren, und etwa 90 % von ihnen metastasieren in die Knochen [4, 5]. Ähnlich wie Knochenmetastasen anderer bösartiger Erkrankungen reagieren CRPC-Metastasen im Knochen zunächst auf gezielte Therapien wie Taxane. Dennoch entwickeln nahezu alle eine Therapieresistenz und werden unheilbar. Bei arzneimittelresistenten Knochenmetastasen können verfügbare Behandlungen wie Denosumab, Zoledronsäure und Bisphosphonate lediglich Symptome oder Morbidität lindern und skelettbezogene Ereignisse (SRE) verhindern oder verzögern. Solche Behandlungen verbessern das Gesamtüberleben der Patienten nicht signifikant [6, 7]. Daher ist die Entwicklung neuartiger und wirksamer Therapien gegen arzneimittelresistente Knochenmetastasen für Prostatakrebs und andere Arten von bösartigen Erkrankungen, die Knochenmetastasen entwickeln, einschließlich Brustkrebs, Lungenkrebs und multiplem Myelom, dringend erforderlich.

Die Knochenumgebung ist reich an TGF-β (Transforming Growth Factor-β), einem Zytokin, das verschiedene physiologische und pathologische Prozesse reguliert. TGF-β spielt eine zentrale Rolle bei der Entwicklung von Knochenmetastasen, auch wenn es die Zellproliferation und das Tumorwachstum in den frühen Stadien der Tumorentstehung unterdrückt [8,9,10,11]. Obwohl die TGF-β-Signalübertragung ein attraktives Ziel für die Behandlung von Knochenmetastasen ist, hat sich die direkte gezielte Behandlung von TGF-β und seinen Rezeptoren aus verschiedenen Gründen als schwierig erwiesen [12,13,14]. Beispielsweise hat TGF-β entscheidende Funktionen bei der Gewebehomöostase [14], und auf TGF-β gerichtete Verbindungen sind häufig nicht selektiv und können daher toxische Wirkungen auf Herzgewebe und Haut haben [15, 16].

Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass TGF-β in Epithelzellen die Acetylierung des Transkriptionsfaktors KLF5 (Krüppel-ähnlicher Faktor 5) an Lysin 369 (K369) induziert [17, 18]. Anschließend bilden TGF-β und acetyliertes KLF5 (Ac-KLF5) eine Signalachse zur Regulierung der Gentranskription und verschiedener zellulärer Prozesse wie Zellproliferation, Zellmotilität und -invasion sowie epithelial-mesenchymaler Übergang (EMT) [17,18,19, 20,21]. Kürzlich haben wir herausgefunden, dass die TGF-β/Ac-KLF5-Achse auch Knochenmetastasen und Arzneimittelresistenzen bei Prostatakrebs induziert [22, 23]. Wichtig ist, dass Prostatakrebsmetastasen aus der TGF-β-reichen Knochenumgebung tatsächlich höhere Mengen an Ac-KLF5 exprimieren als Metastasen aus viszeralen Geweben [23]. Die Tatsachen, dass TGF-β und Ac-KLF5 eine Achse bilden und dass Ac-KLF5 für TGF-β essentiell ist, um Knochenmetastasen zu induzieren, legen nahe, dass Ac-KLF5 und seine nachgeschalteten Effektoren alternative therapeutische Ziele für die Behandlung von TGF-β-induzierter Erkrankung sind Knochenmetastasen bei PCa.

In dieser Studie haben wir einen In-vitro-Sphäroidinvasions-Screening-Assay für Prostatakrebszellen angewendet, die KLF5K369Q exprimieren, eine Mutante, die Ac-KLF5 nachahmt [22, 23]. Mit dem System haben wir 1987 von der FDA zugelassene Arzneimittel untersucht, um Arzneimittel zu identifizieren, die die Zellinvasion und Knochenmetastasierung hemmen. Hier beschreiben wir die Screening-Ergebnisse und präsentieren Daten, die belegen, dass das Anthelminthikum Nitazoxanid (NTZ) in einem Mausmodell ein wirksamer Inhibitor der Knochenmetastasierung ist. Wir präsentieren auch zelluläre und molekulare Daten, die die hemmende Wirkung von NTZ auf Knochenmetastasen unterstützen und Mechanismen dafür liefern, wie NTZ bei der Unterdrückung von Knochenmetastasen wirkt.

Die von der FDA zugelassene Medikamentenbibliothek Mini (Kat.-Nr.: HY-L022M), die 1987 Medikamente in 96-Well-Platten enthielt und in 10 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) bei 10 mM gelöst war, wurde von MedChemExpress (Shanghai, China) erworben. Zusätzliches Nitazoxanid (Kat.-Nr.: HY-B0217) wurde von MedChemExpress erworben und in DMSO bei einer Konzentration von 100 mM gelöst.

Wir haben zuvor stabile menschliche PCa-Zelllinien PC-3 und DU 145 etabliert, die den Wildtyp KLF5, den Ac-KLF5-nachahmenden Mutanten KLF5K369Q (KQ), den Acetylierungsdefizienten Mutanten KLF5K369R (KR) und die pLHCX-Vektorkontrolle exprimieren [22]. PC-3-Zellen, die verschiedene Formen von KLF5 exprimieren, einschließlich PC-3-KLF5, PC-3-KQ, PC-3-KR und PC-3-pLHCX, wurden in RPMI-1640-Medium gehalten, das mit 10 % fötalem Rinderserum ergänzt war (FBS, Biological Industries, HAMEK, Israel) und 1 % Penicillin/Streptomycin (100 U/ml, Biological Industries). DU 145-Zellen, die verschiedene Formen von KLF5 exprimieren, wurden in Eagle's Minimum Medium (MEM) (Corning, New York, USA) mit 10 % FBS kultiviert.

PC-3-KLF5-, PC-3-KQ- und PC-3-KR-Zellen wurden mit Lentiviren infiziert, die die Luciferase exprimierten (HBLV-LUC-PURO, Hanbio, Shanghai, China). Infizierte Zellen wurden auf stabile Zellpopulationen in einem Medium mit Puromycin (2 μg/ml) selektiert.

Die Makrophagenzelllinie RAW264.7 wurde von American Type Cell Culture (ATCC, Manassas, VA, USA) erhalten und in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Biological Industries), ergänzt mit 10 % FBS, kultiviert. Alle Zellen wurden bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 kultiviert.

PC-3-Zellen, die verschiedene Formen von KLF5 exprimieren, wurden in einem serumfreien Medium suspendiert und in der oberen Kammer eines Trans-Well-Geräts (Kat.-Nr.: 353097, Corning) mit 5 × 104 Zellen pro Well ausgesät. In die untere Kammer wurden 750 μl Komplettmedium mit 15 % FBS gegeben. Achtundvierzig Stunden später wurden die Zellen auf der Oberseite der Membran mit einem Wattestäbchen abgekratzt, während die Zellen auf der Unterseite mit violettem Kristall (Kat.-Nr.: C0121, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) gefärbt und mit einem Stereoskop fotografiert wurden (Mshot, Guangzhou, China). Die Membran wurde dann in der unteren Kammer in 500 μl 33 %ige Essigsäure gegeben, um die Zellen aufzulösen. Die optischen Dichten gelöster Zellen wurden mit einem Mikroplattenlesegerät (BioTek, Winooski, Vermont, USA) bei 570 nm gemessen.

Der Invasionsassay wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [24]. Kurz gesagt, PC-3-KQ-Zellen mit einer Konfluenz von 80–90 % wurden auf 384-Well-Rundbodenplatten mit extrem geringer Anhaftung (Kat.-Nr.: 4516, Corning) mit 500 Zellen pro Well in 80 μl Medium ausplattiert. Die Platten wurden dann 4 Minuten lang bei 320 g zentrifugiert, um Zellen am Boden der Vertiefungen zu sammeln, und 3 Tage lang inkubiert. Am vierten Tag wurden 40 μl Medium aus jeder Vertiefung entnommen, 40 μl der Matrigel-Medium-Mischung in jede Vertiefung gegeben und die Zellen weitere 3 Tage kultiviert. Das Matrigel (Kat.-Nr.: 354234, Corning) stammte von Corning und das Medium enthielt 1 % FBS. Am Ende der Inkubation wurden Bilder mit einem Phasenkontrastmikroskop (Eclipse Ti2, Nikon, Tokio, Japan) mit 10-fachen Objektiven aufgenommen und die Gesamtfläche der Zellen und die Kernkugelfläche der Zellen ermittelt (Abb. 1a). gemessen mit der Image J-Software. Die Invasionsfläche wurde nach folgender Formel berechnet: Invasionsfläche = Gesamtfläche der Zellen – Kernkugelfläche [25].

Screening von FDA-zugelassenen Arzneimitteln auf solche, die die durch acetyliertes KLF5 induzierte Zellinvasion hemmen. ein Schema des Screening-Workflows. b Hemmende Wirkung von 1987 von der FDA zugelassenen Arzneimitteln zusammen mit der Vehikelkontrolle (grüne Punkte durch grüne Pfeile angezeigt) auf die Invasion von PC-3-KQ-Zellen, analysiert mit dem 3D-Sphäroid-Invasionstest. Jeder Punkt stellt ein Medikament oder eine Kontrolle dar und die Punkte sind entlang der X-Achse ausgerichtet. Die Y-Achse zeigt die durchschnittliche Invasionsfläche zwischen zwei Vertiefungen für jedes Medikament an. Die blaue horizontale Linie zeigt die mittlere Invasionsfläche aller Medikamente und Kontrollen an, während die rote horizontale Linie 50 % der mittleren Invasionsfläche anzeigt. c Anteile der 1987 zugelassenen Arzneimittel als nicht-onkologische Arzneimittel (violette Farbe), onkologische gezielte Therapeutika (orange Farbe) und onkologische Chemotherapeutika (rote Farbe). d Identifizierung der wirksamsten 25 Medikamente mithilfe des 3D-Sphäroidinvasionstests mit mehreren Konzentrationen (μM). Die Heatmap zeigt die Invasionsraten (%) der verschiedenen Konzentrationen jedes Arzneimittels im Vergleich zur Vehikelkontrolle, angezeigt durch blaue Gitter mit unterschiedlichen Intensitäten. Die Namen der 25 Medikamente werden unten angezeigt, wobei 6 der wirksamsten durch rote Kästchen markiert sind. e Die chemische Struktur von Nitazoxanid

Für das Arzneimittelscreening wurden beim Ersetzen des Kulturmediums am 4. Tag Arzneimittel zur Matrigel-Medium-Mischung hinzugefügt. Für die erste Screening-Runde wurde für alle Arzneimittel eine Endkonzentration von 10 μM verwendet. Für die zweite Screening-Runde wurden mehrere Arzneimittelkonzentrationen verwendet, darunter 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 und 10 μM. Für jede Konzentration wurden doppelte Vertiefungen wiederholt.

Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurde die Lebensfähigkeit der Zellen mit einem Kit von Beyotime Biotechnology gemessen. Kurz gesagt wurden Zellen mit 5 × 103 Zellen pro Vertiefung auf 96-Well-Platten ausgesät, über Nacht inkubiert und dann 48 Stunden lang mit Arzneimitteln bei 0, 0,02, 0,05, 0,14, 0,41, 1,23, 3,7, 11,1, 33,3 und 100 behandelt μM. Vier Medikamente wurden analysiert: Furagin, Nifuratel, Nitazoxanid und Retapamulin. Am Ende der Arzneimittelbehandlung wurde das Medium entfernt, die CCK-8-Lösung in jeder Vertiefung mit 100 μl/Vertiefung hinzugefügt und 1,5 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, und die optische Dichte (OD) wurde bei 450 nm gemessen ein Mikroplatten-Reader (BioTek).

Wir haben auch einen größeren Bereich von NTZ-Konzentrationen in PC-3-KQ- und DU 145-KQ-Zellen mithilfe des CCK-8-Assays getestet, indem wir 2 × 103 Zellen und 2,5 × 103 Zellen in jede Vertiefung von Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät haben. PC-3-KQ-Zellen wurden mit NTZ bei 0, 0,01, 0,1, 1,25, 2,5 und 5 μM behandelt, während DU 145-KQ-Zellen mit NTZ bei 0, 0,01, 0,1, 5, 10 und 20 behandelt wurden μM für 0, 24, 48 und 72 Stunden. Die Anzahl lebensfähiger Zellen wurde mit der oben beschriebenen CCK-8-Lösung bestimmt.

PC-3-KQ- und DU 145-KQ-Zellen wurden auf 6-Well-Platten mit 1 × 103 Zellen/Well ausgesät. Nach 24-stündiger Inkubation wurden PC-3-KQ-Zellen mit NTZ bei 0, 1,25, 2,5 und 5 μM behandelt, während DU 145-KQ-Zellen 8 Tage lang mit NTZ bei 0, 5, 10 und 20 μM behandelt wurden . Das wirkstoffhaltige Medium wurde alle 2 Tage ausgetauscht. Am 8. Tag wurden die Zellen mit kaltem PBS gespült, 10 Minuten mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, 10 Minuten mit violetten Kristallen gefärbt und fotografiert, und die Bilder wurden mit der Image J-Software analysiert.

Männliche Balb/c-Nacktmäuse im Alter von 3–4 Wochen wurden von Charles River (Peking, China) gekauft. Bei ihrer Ankunft im Tierzentrum der Southern University of Science and Technology (SUSTech) wurden die Mäuse vor der Verwendung eine Woche lang unter Quarantäne gestellt. Alle Mäuse wurden gemäß dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren gehalten und behandelt.

Um zu messen, ob NTZ die Ac-KLF5-induzierte Knochenmetastasierung hemmt, verwendeten wir sowohl Präventions- als auch Therapiemodi. Für das Präventionsmodell wurden Mäuse nach einer kürzlich veröffentlichten Methode [26] anästhesiert, die Schwanzarterie mit Alkohol abgewischt, um das Blutgefäß zu erweitern, und 1×106 Zellen Krebszellen (PC-3-KQ-Luc oder PC-3 -KR-Luc-Zellen) in 100 μl PBS wurden in kurzer Zeit (< 3 s) in die Schwanzarterie injiziert [26]. Anschließend wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in Vehikel- und NTZ-Gruppen eingeteilt (sechs Mäuse in jeder Gruppe) und erhielten am Tag 0 eine Behandlung. Das Tumorwachstum und das Körpergewicht wurden jede Woche bestimmt. Nach 5-wöchiger Behandlung wurden alle Mäuse getötet und Knochengewebe und wichtige Organe zur Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) reseziert. Die Auswahl von 5 Wochen für die Untersuchung basiert auf dem Pilotversuch, bei dem sich 5 Wochen nach der Injektion deutliche Knochenmetastasen bildeten, in anderen Organen, einschließlich Gehirn, Leber, Lunge, Milz, Herz, Prostata und Samenblase, jedoch keine Tumoren festgestellt wurden , Dünndarm und Hoden (Daten nicht gezeigt).

Für das Therapiemodell wurden 1 × 106 PC-3-KQ-Luc-Zellen in 100 μl PBS wie oben beschrieben in die Schwanzarterie jeder Maus injiziert. Alle 7 Tage wurden die Mäuse einer Biolumineszenz (BL)-Bildgebung unterzogen und zufällig in die Vehikel- und NTZ-Gruppen aufgeteilt (n = 6 pro Gruppe) und erhielten am 7. Tag eine Behandlung. Das Tumorwachstum und das Körpergewicht wurden jede Woche gemessen. 35 Tage nach der letzten Behandlung wurde das Knochengewebe jeder Gruppe für eine hochauflösende Mikrocomputertomographie (Mikro-CT), H&E-Färbung und immunhistochemische Färbung entnommen.

Das Tumorwachstum im Knochen wurde einmal pro Woche durch In-vivo-BL-Bildgebung mit der Living Image Software 4.4 (IVIS Spectrum, PerkinElmer Health Sciences, Massachusetts, USA) bestimmt. Zehn Minuten nach der intraperitonealen Injektion von D-Luciferin-Natriumsalz (15 mg/ml, 10 μl/g KG) (GM-040611, Genomeditech, Shanghai, China) wurden Biolumineszenzbilder unter folgenden Bedingungen aufgenommen: offener Emissionsfilter, Belichtungszeit = 60 s, Binning = mittel: 8, Sichtfeld = 12,9 × 12,9 cm und Blende = 1. Die Bilder wurden dann mit der Living Image 4.4-Software (PerkinElmer) analysiert. Am Ende der Behandlung wurden die Biolumineszenzintensitäten anhand des Photonenflusses der Region of Interest (ROI) gemessen und zwischen der Vehikel- und der NTZ-Behandlungsgruppe verglichen.

Zur medikamentösen Behandlung wurde 1 % Natriumcarboxymethylcellulose (CMC) (Kat.-Nr.: CC0113, Leagene Biotechnology, Peking, China) als Vehikelkontrolle verwendet und NTZ in CMC gelöst. NTZ wurde Mäusen täglich durch intragastrische Verabreichung (100 mg/kg KG) verabreicht.

Nach der Tötung der Mäuse wurden die Hinterbeine entfernt und 48 Stunden lang in 4% Paraformaldehyd fixiert. Anschließend wurden die Gliedmaßen mit einem Mikro-CT-Scanner (Skyscan1276, Bruker, Kontich, Belgien) gescannt. Für die Mikro-CT-Bildgebung waren die Scanparameter: Quellenspannung 60 kV; Quellstrom, 100 μA; AI 0,5 mm Filter; Pixelgröße: 10 μm; Rotationsschritt, 0,4 Grad. Die Bilder wurden dann mit der NRecon-Software (Version 1.7.1.6, Bruker) verarbeitet und konstruiert und mit Dataviewer (Version 1.5.4, Bruker) konvertiert. Der interessierende Bereich (ROI), der 0,5 mm von der Femurwachstumsfuge entfernt liegt, wurde mit dem Programm CT-Analyser (CTAn) analysiert. Zu den Parametern gehörten Knochenvolumen/Gesamtvolumen (BV/TV), Trabekelzahl (Tb.N), Trabekelabstand (Tb.Sp) und Trabekeldicke (Tb.Th). Abschließend wurden die 3D-Bilder in der CTvox-Software (Version 2.0, Bruker) erstellt.

Die Femuren wurden 14–21 Tage lang in einer Entkalkungslösung aus Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (Kat.-Nr.: R20403-5L, OKA, Peking, China) entkalkt. Nach der Entkalkung wurde das Knochengewebe in einem Ethanolgradienten von 70 bis 95 % dehydriert, 6 Stunden lang in n-Butanol eingeweicht und dann in Paraffin eingebettet. Gewebeblöcke wurden in 4 μm große Abschnitte geschnitten. Nach 1,5-stündigem Backen in einem Ofen bei 63 °C wurden die Gewebeträger mit Xylol entparaffiniert, mit Gradienten-Ethanol hydratisiert und dann mit H&E (Kat.-Nr.: BA4025, BaSO, Zhuhai, China) gefärbt. Anschließend wurden die Objektträger zur Analyse mit neutralen Harzen montiert (Kat.-Nr.: 25608-33-7, Sigma-Aldrich, MO, USA).

Die immunhistochemische Färbung wurde nach etablierten Verfahren durchgeführt. Kurz gesagt, 4-μm-Schnitte von Knochengewebe wurden in Xylol entparaffiniert und in Gradienten-Ethanol rehydratisiert. Das endogene Antigen wurde durch Inkubieren der Objektträger in 10 mM Natriumcitratpuffer (Kat.-Nr.: C1010, Solarbio, Peking, China) über Nacht in einem Ofen bei 65 °C gewonnen. Nach der Antigengewinnung wurden die Gewebeschnitte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 3 % Wasserstoffperoxid inkubiert, um die endogene Katalaseaktivität zu blockieren. Anschließend wurden sie 40 Minuten lang in einer Blockierungslösung (0,1 % Rinderalbumin V gemischt mit 10 % Ziegenserum) und einer Lösung mit einem Primärantikörper (MMP9, 1:1000, Kat.-Nr.: ab76003, Abcam, Cambridge, UK; MYBL2, 1:100, Kat.-Nr.: ab76009, Abcam) für 1,5 Stunden. Nach dreimaligem Spülen mit PBS wurden die Objektträger 15 Minuten lang mit der sekundären Antikörperlösung und dann mit der DAB-Lösung unter Verwendung des MaxVision II HRP-Kits (Kat.-Nr.: KIT-5920, MXB Biotechnologies, Fuzhou, China) inkubiert. Die Kerne wurden 2 Minuten lang mit Hämatoxylin gegengefärbt. Anschließend wurden die Objektträger mit Gradienten-Ethanol (75–100 %) und Xylol dehydriert und mit Deckgläsern unter Verwendung des schnellhärtenden Eindeckmediums montiert. Alle Objektträger wurden mit einem Aperio VERSA 8 Scannersystem (Leica, Wetzlar, Deutschland) gescannt und mit der Image J-Software (Image J 1.48v, NIH, Bethesda, MD, USA) analysiert.

Für den In-vitro-Osteoklastendifferenzierungstest wurden drei verschiedene Kultursysteme verwendet. Im ersten Versuch wurden RAW264.7-Zellen mit 1 × 103 Zellen/Well auf 96-Well-Platten ausgesät und über Nacht kultiviert. Die Zellen wurden dann mit rekombinantem Maus-RANKL (Kat.-Nr.: CR06, Novoprotein, Shanghai, China) bei 50 ng/ml in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener NTZ-Konzentrationen (0, 6,25, 12,5, 25 μM) stimuliert. Das Medium wurde alle 2 Tage ausgetauscht, bis Osteoklasten in der Kontrollgruppe beobachtet wurden. Die Zellen wurden dann 10 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert, mit vorgewärmtem entionisiertem Wasser gespült und mit tartratresistenter saurer Phosphatase (TRAP) unter Verwendung eines Kits von Sigma-Aldrich (Kat.-Nr.: A387) gefärbt, um Osteoklasten (≥ 3 Kerne/ Zelle). Die Wirkung von NTZ auf die Osteoklastendifferenzierung wurde durch Zählen der Anzahl mehrkerniger Zellen mithilfe der Image J-Software (Bild J 1.48v) bestimmt.

Im zweiten In-vitro-Test verwendeten wir konditioniertes Medium (CM) aus NTZ-behandelten Ac-KLF5-exprimierenden Zellen. PC-3-KQ-Zellen wurden in 6-Well-Platten mit 1 × 105 Zellen pro Well ausgesät und über Nacht kultiviert. Die Zellen wurden 36 Stunden lang mit NTZ bei 0, 1,25, 2,5 und 5 μM in Vollmedium (RPMI1640 mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin) behandelt. Das Medium wurde entfernt und die Zellen wurden zweimal mit dem RPMI1640-Medium, das 0,5 % FBS enthielt, gewaschen und weitere 12 Stunden im gleichen Medium kultiviert. Anschließend wurden die konditionierten Medien (CM) von jeder Gruppe gesammelt, zentrifugiert, filtriert, aliquotiert und zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert oder sofort in den Co-Kultivierungsexperimenten verwendet. CM aus jeder Gruppe wurde mit dem DMEM-Medium (10 % FBS) im Verhältnis 1:3 gemischt und RANKL wurde in einer niedrigeren Konzentration (10 ng/ml) hinzugefügt. RAW264.7-Zellen in 96-Well-Platten mit 24-Stunden-Kultur wurden 7 Tage lang mit dem CM-haltigen Medium inkubiert, wobei das Medium alle 2 Tage ausgetauscht wurde. Der TRAP-Färbetest wurde durchgeführt, um die Anzahl differenzierter Osteoklasten gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen.

Der dritte In-vitro-Assay umfasste eine direkte Co-Kultur zwischen RAW264.7-Zellen und Krebszellen. RAW264.7-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit 700 Zellen pro Well ausgesät und 12 Stunden lang anhaften gelassen. Zu jeder Vertiefung wurden PC-3-KQ-Zellen in einer Menge von 300 Zellen/Vertiefung gegeben, und die Kultur wurde 12 Stunden lang fortgesetzt. NTZ wurde zur Behandlung der Zellen 48 Stunden lang in verschiedenen Endkonzentrationen (0, 1,25, 2,5, 5 μM) zugesetzt. Das RAW264.7-Medium wurde mit dem PC-3-Medium im Verhältnis 7:3 gemischt und die Mischung wurde alle zwei Tage zum Ersetzen des Kulturmediums verwendet. Nach 7 Tagen wurde die Osteoklastendifferenzierung wie oben beschrieben bestimmt.

Das Verfahren zur TRAP-Färbung in Geweben wurde in unserer vorherigen Studie beschrieben [23]. Kurz gesagt, entparaffinierte und hydratisierte Knochenschnitte wurden 20 Minuten lang in 0,2 M Essigsäure und dann etwa 20 Minuten lang in 0,2 M Essigsäure, die das Echtrot-TR-Salz (1,1 mg/ml) und Naphthol-AS-MX-Phosphat (0,5 mg/ml) enthielt, inkubiert 45 Min. bei 37°C. Wenn TRAP-positive Zellen rot werden, wie mithilfe der Mikroskopie überwacht, wurden die Objektträger mit Hämatoxylin gegengefärbt und mit Deckgläsern unter Verwendung von Glycerin versehen. Anschließend wurden die Objektträger wie oben beschrieben gescannt und analysiert.

PC-3-KQ- und PC-3-KR-Zellen wurden auf 6-Well-Platten mit 1 × 105 Zellen/Well ausgesät und 24 Stunden lang kultiviert. Das Kulturmedium wurde dann durch eines mit 0 oder 5 μM NTZ ersetzt und die Behandlung dauerte 48 Stunden. Anschließend wurden die Zellen einmal mit vorgekühltem PBS gespült und im TRIzol-Reagenz (Kat.-Nr.: 15596018, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) gesammelt. Die Extraktion von RNA, der Aufbau von Bibliotheken unter Verwendung des SE100-Protokolls und die Sequenzierung mit einer DNBSEQ-Plattform mit einer Sequenzierungslänge am Paarende von 100 bp wurden vom Beijing Genomics Institute (Wuhan, China) durchgeführt. Die Rohdatenverarbeitung wurde wie zuvor beschrieben abgeschlossen [14]. Alle RNA-seq-Daten wurden von FASTQC zur Qualitätsbewertung verarbeitet und mithilfe von Bowtie2 (V2.2.5) an das menschliche Genom angepasst [27].

Der EdgeR-Algorithmus wurde durchgeführt, um unterschiedlich exprimierte Gene zwischen KLF5K369Q- und KLF5K369R-exprimierenden Zellen sowie die NTZ-Behandlung und -Kontrolle in KLF5K369Q-exprimierenden Zellen mit einer |fachen Änderung| zu identifizieren ≥ 1,5 und eine Falscherkennungsrate < 0,05. Unsere Sequenzierungsdaten wurden in der Gene Expression Omnibus-Datenbank mit der Zugangsnummer GSE216126 hinterlegt.

Für die Gene, deren Expression spezifisch durch KLF5K369Q moduliert wurde und deren Modulation durch NTZ abgeschwächt wurde, wurde die Kaplan-Meier-Überlebensanalyse durchgeführt, um zu bewerten, ob die Expressionsänderungen eines Gens bei menschlichem Prostatakrebs mit dem Überleben des Patienten zusammenhängen. Wir haben Daten des East Coast Dream Team (ECDT) der Stand Up To Cancer/Prostate Cancer Foundation (SU2C/PCF) (https://www.cbioportal.org/) mithilfe des Survival R-Pakets analysiert. Die Patienten wurden basierend auf dem mittleren Expressionsgrad eines Gens in jedem Datensatz in zwei Gruppen eingeteilt. Zur Berechnung der p-Werte wurde der Log-Rank-Test verwendet. Es wurden auch univariate Hazard Ratios berechnet.

Gene, die signifikant mit dem Überleben assoziiert sind, wurden anhand des SU2C/PCF-Datensatzes (28) und des GSE21034-Datensatzes (29) hinsichtlich ihrer Expressionsniveaus in normalem Prostatagewebe, Prostatakrebs und Knochenmetastasen verglichen. Der Wilcoxon-Rangsummentest wurde zur Bestimmung der p-Werte für Vergleiche zwischen zwei Gruppen verwendet, während der Kruskal-Wallis-Test für Mehrgruppenvergleiche verwendet wurde. Es wurden zweiseitige statistische Tests durchgeführt und ein ap-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle Analysen wurden in R4.1.3 (https://www.R-project.org/) ausgeführt.

Die Gesamt-RNA wurde mit dem Eastep Super Total RNA Extraction Kit (Kat.-Nr.: LS1040, Promega, Shanghai, China) aus Zellen extrahiert und mit dem NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Madison, USA) quantifiziert. Einzelstrang-cDNA wurde aus 1 μg Gesamt-RNA unter Verwendung des HiScript III All-in-one RT SuperMix-Kits (Kat.-Nr.: R333-01, Vazyme, Nanjing, China) synthetisiert. Für die qRT-PCR wurde die cDNA-Vorlage mit dem SYBR Green-Reagenz in enzymfreiem Wasser gemischt und das Qtower3-Touch-System (Analytik Jena, Jena, Deutschland) für die PCR mit dem folgenden Programm verwendet: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 5 Minuten, 40 Zyklen mit 95 °C für 30 Sekunden, 60 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 30 Sekunden und abschließendes Schmelzen für 15 Sekunden. GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet. Die Primersequenzen waren wie folgt: 5'-CTTGAGCGAGTCCAAAGACTG-3' (MYBL2 vorwärts), 5'-AGTTGGTCAGAAGACTTCCCT-3' (MYBL2 rückwärts), 5'-CAGCATTTCATCGAGGTAGAGAC-3' (TIMM8A vorwärts), 5'-AGCCCGACTGTCCAACTTTG-3' ( TIMM8A rückwärts), 5′-TGAAGGTGACAGAGCCTCTGGAT-3′ (E-Cadherin vorwärts), 5′-TGGGTGAATTCGGGCTTGTT-3′ (E-Cadherin rückwärts), 5′-TGAAGGTGACAGAGCCTCTGGAT-3′ (Vimentin vorwärts), 5′-CTTGTAGGAGTGTCGGTTGTTAAG-3 ′ (Vimentin rückwärts), 5′-GACAATGCCCCTCAAGTGTT-3′ (N-Cadherin vorwärts), 5′-CCATTAAGCCGAGTGATGGT-3′ (N-Cadherin rückwärts), 5′-CTTCCAGCAGCCCTACGAC-3′ (Schnecke vorwärts), 5′-CGGTGGGGTTGAGGATCT -3′ (Schnecke rückwärts), 5′-TGTTTGCAAGATCTGCGGC-3′ (Schnecke vorwärts), 5′-TGCAGTCAGGGCAAGAAAAA-3′ (Schnecke rückwärts), 5′-CCATAAAGGGCAACCAAGAG-3′ (Fibronektin vorwärts), 5′-ACCTCGGTGTTGTAAGGTGG-3 ′ (Fibronektin rückwärts), 5′-TGCAGTCAGGGCAAGAAAAA-3′ (Slug rückwärts), 5′-TGTACCGCTATGGTTACACTCG -3′ (MMP9 vorwärts), 5′-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3′ (MMP9 rückwärts), 5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′ ( GAPDH vorwärts) und 5′-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′ (GAPDH rückwärts).

Zellen in Platten mit 6 Vertiefungen wurden mit kaltem PBS gewaschen und in einem Lysepuffer, der Phosphatase- und Proteaseinhibitoren enthielt (Kat.-Nr.: P1045, Beyotime), gesammelt, um Proteine ​​zu extrahieren. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 4 °C in einer Kühlzentrifuge wurde der Überstand gesammelt und mit dem 4-fachen Ladepuffer gemischt, 10 Minuten lang in einem Metallwärmebad bei 100 °C gekocht und dann einer 10 %igen SDS-PAGE unterzogen . Die Proteine ​​wurden auf eine aktivierte PVDF-Membran (0,45 μm Porengröße, Kat.-Nr.: IPVH00010, Millipore, Carrigtwohill, Irland) übertragen. Die Membran wurde mit 5 % Magermilch 40 Minuten lang bei Raumtemperatur blockiert, mit einem Primärantikörper über Nacht bei 4 °C inkubiert, dreimal mit PBS gewaschen (jeweils 10 Minuten) und mit HRP-konjugiertem Sekundärantikörper gegen das Kaninchen-IgG inkubiert (1:5000, Kat.-Nr.:7074S, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Signale wurden unter Verwendung des ECL-Substratreagenzes (Kat.-Nr.: K-12043-D20, Advansta, Kalifornien, USA) in einem automatischen Chemilumineszenzanalysator (ChampChemi 610 plus, Peking, China) sichtbar gemacht. Der GAPDH-Antikörper wurde von Cell Signaling Technology (1:2000, Kat.-Nr.: 5174S) erworben, der KLF5-Antikörper stammte von Proteintech (1:1000, Kat.-Nr.: 21017-1-AP, Chicago, USA), der MYBL2-Antikörper stammte von Abcam (1:2000, Kat.-Nr.: ab76009, Cambridge, MA, USA) und der MMP9-Antikörper stammte von Abcam (1:2000, Kat.-Nr.: ab 76003).

Kleine interferierende RNAs (siRNAs) für KLF5 und Negativkontrolle wurden von Ribobio (Guangzhou, China) synthetisiert und zur Transfektion von Zellen bei 50 nM unter Verwendung des Lipofectamine RNAiMax-Reagenz (Kat.-Nr.: 13778150, Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Nach 48 Stunden wurden die Zellen für Analysen gesammelt, einschließlich des Knockdown-Effizienztests durch Western Blot. Die Sequenz der KLF5-siRNA war 5'-AAGCUCACCUGAGGACUCA-3′ [30].

Der ChIP-Assay wurde mit dem SimpleChIP Enzymatic Chromatin IP-Kit (Kat.-Nr.: 9003s, Cell Signaling Technology) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, die Zellen wurden zur Vernetzung 10 Minuten lang mit 1 % Formaldehyd behandelt, 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Glycin gequencht, gesammelt und 20 Minuten lang bei 37 °C mit Mikrokokken-Nuklease verdaut. Nach Stoppen der Reaktion durch Zugabe von EDTA wurde die DNA durch Ultraschall fragmentiert und die Extrakte mit KLF5-Antikörper (Kat.-Nr.: 21017-1-AP, Proteintech) oder IgG (Kat.-Nr.: 2729P, Cell Signaling Technology) inkubiert. Eluierte DNA-Fragmente wurden durch reguläre PCR und quantitative Echtzeit-PCR unter Verwendung der folgenden Primer nachgewiesen: 5′-CCTTCCTCGGTCTTCGCTAT-3′ (MYBL2 #1 vorwärts), 5′-GCACTTTTCTATCTCCCGCCA-3′ (MYBL2#1 rückwärts), 5′- CCTGGAGATACTGGTGTGCAT-3‘ (MYBL2 #2 vorwärts) und 5‘-GGCCAAAAAGAACGGCCTCT-3‘ (MYBL2 #2 rückwärts).

Wildtyp-KLF5 und die KLF5K369Q- und KLF5K369R-Mutanten wurden in den pET15b-Expressionsvektor (Kat.-Nr.: ZK146, Zoman Biotechnology, Peking, China) kloniert, in dem bei der Expression ein Histidin-Tag an den N-Terminus des KLF5-Proteins hinzugefügt wurde. Die Plasmide wurden im E. coli-Stamm BL21 DE3 (Kat.-Nr.: EC1003, Weidi Biotechnology, Shanghai, China) exprimiert. Bakterien wurden durch Zentrifugation gesammelt, in 10 mM Imidazol in PBS (10 mM, pH 7,4) beschallt und mit dem His60 Ni Superflow-Harz (Kat.-Nr.: L00666, GenScript, Nanjing, China) inkubiert. His-KLF5-Harzkomplexe wurden mit 300 mM Imidazol in PBS (10 mM, pH 7,4) gewaschen und eluiert. Das KLF5-Protein wurde durch Gelfiltration auf einer Superdex 200 Erhöhung 10/300-Säule (Kat.-Nr.: 10243519, GE, MA, USA) unter Verwendung von PBS (10 mM, pH 7,4) zur Verwendung in Bindungstests weiter gereinigt.

Das Fluoreszenzspektrum von Wildtyp- oder mutiertem KLF5-Protein bei 1 μM in 2 ml PBS wurde mit einem Fluoreszenzspektrometer (HORIBA, Kyoto, Japan) gemessen und die Fluoreszenzspektren wurden für Wellenlängen von 300–500 nm erhalten. In der Analyse wurden NTZ mit verschiedenen Konzentrationsbereichen und verschiedenen Inkrementen verwendet, darunter 0,1–1 μM mit einem Inkrement von 0,1 μM, 1–5 μM mit einem Inkrement von 0,5 μM, 5–10 μM mit einem Inkrement von 1 μM und 10 –30 μM mit einer Schrittweite von 5 μM. Die Inkubation mit NTZ erfolgte 5 s bei Raumtemperatur. Die Daten wurden verarbeitet und angepasst, um die Bindungsaffinitäten mithilfe der Origin-Software (OriginLab, Northampton, MA, USA) zu erhalten, und die Kd-Werte wurden anhand der Reaktionen bei einer Wellenlänge von 290 nm bestimmt.

Gereinigtes KLF5-Protein oder sein Mutant mit 0,5 mg/ml in 0,5 ml wurde mit His60 Ni Superflow-Harz 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zweimaligem Waschen wurden die Protein-Kügelchen-Komplexe in PBS auf 1 ml verdünnt. Als Negativkontrolle (d. h. Leerwert) wurde His60 Ni Superflow-Harz ohne Protein verwendet. Den Protein-Kügelchen-Komplexen wurden zehn Mikroliter 1 mM NTZ zugesetzt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionen wurden mit PBS gewaschen und dann mit Acetonitril inkubiert, um Protein zu denaturieren und eingefangenes NTZ freizusetzen. NTZ im Überstand wurde dann durch HPLC-Analyse unter Verwendung des Agilent 1260 Infinity II-Instruments (Kalifornien, USA) und der C18-Säule (25 cm × 4,6 mm, 5 μm) mit einer Flussrate von 0,5 ml/min für 20 Minuten nachgewiesen Wellenlänge von 298 nm.

Wildtyp- oder mutiertes KLF5-Protein in 2 ml PBS mit 0,01 mg/ml wurde mit einem CD-Spektropolarimeter (Chirascan, Applied Photophysics, Surrey, UK) bei 200–260 nm analysiert. Die Spektren wurden in einer Küvette mit 1 cm Schichtdicke aufgenommen. Für jedes Spektrum wurden durchschnittlich drei wiederholte Scans durchgeführt. NTZ wurde der Proteinlösung in einer Endkonzentration von 1 μM zugesetzt und vor dem CD-Nachweis 2 Stunden lang bei 4 °C inkubiert.

Quantitative Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt und alle Experimente wurden mindestens drei Mal wiederholt. Für die statistische Analyse wurde der Student-T-Test oder die einfache ANOVA verwendet. Alle statistischen Analysen wurden mit der GraphPad Prism 6-Software durchgeführt [31]. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Wir haben bestätigt, dass PC-3-Zellen unter den häufig verwendeten Prostatakrebszelllinien (LNCaP, C4-2B, PC-3 und DU 145) den höchsten KLF5-Spiegel exprimieren (Zusatzdatei 1: Abb. S1a). Wir haben daher die zuvor etablierten KLF5-Null-PC-3-Zelllinien, die das Wildtyp-KLF5, die Ac-KLF5-nachahmende KLF5K369Q-Mutante und die Acetylierungsdefiziente KLF5K369R-Mutante exprimieren, für das Arzneimittelscreening und die Metastasierungsmodellierung ausgewählt. Die Expressionsniveaus von KLF5 in diesen Zelllinien sind in Abb. S1b dargestellt. Wir haben auch bestätigt, dass KLF5K369Q-exprimierende Zellen im Transwell-Assay migrativer (Zusatzdatei 1: Abb. S1c, S1d) und invasiver waren (Zusatzdatei 1: Abb. S1e, S1f) als KLF5- und KLF5K369R-exprimierende Zellen. Wie erwartet exprimierten KLF5K369Q-exprimierende Zellen auch höhere Mengen an mesenchymalen Markern, einschließlich Vimentin, N-Cadherin, Schnecke, Schnecke und Fibronektin (Zusatzdatei 1: Abb. S1g, S1h).

Der 3D-Sphäroidinvasionstest wurde verwendet, um 1987 von der FDA zugelassene Arzneimittel auf ihre Fähigkeit zu testen, die Zellinvasion zu hemmen (Abb. 1a). Bei 10 μM hemmten 87 der Medikamente von 1987 die Zellinvasion um mindestens 50 %, darunter 9 Chemotherapeutika, 32 zielgerichtete Krebsmedikamente und 46 nicht-onkologische Medikamente (Abb. 1b, c; Zusatzdatei 2: Tabelle S1).

Für die 87 Arzneimittel wiederholten wir das Invasionsscreening mit einer Reihe von Konzentrationen für jedes Arzneimittel, darunter 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 und 10 μM. Die Auswirkungen dieser Medikamente auf die Zellinvasion sind in Tabelle S1 aufgeführt. Der Invasionstest mit mehreren Arzneimittelkonzentrationen wurde für die 25 besten der 87 Arzneimittel wiederholt, die eine dosisabhängige Invasionshemmung zeigten, und ihre Fähigkeit zur Invasionshemmung wurde erneut bestätigt (Zusatzdatei 2: Tabelle S2). Diese 25 Medikamente sind in Tabelle 1 in der Reihenfolge ihrer Invasionshemmwirkung aufgeführt.

Für diese 25 Medikamente haben wir die PubMed-Datenbank nach Veröffentlichungen durchsucht, die den Namen eines Medikaments und „Krebs“, „Metastasierung“ oder „Knochenmetastasierung“ enthielten, um zu bewerten, ob diese Medikamente mit Krebs und Metastasierung in Zusammenhang stehen. Von den 25 Medikamenten wurden 11 in der Literatur eindeutig mit Krebs oder Metastasierung in Verbindung gebracht, während es für 14 nur begrenzte oder keine krebsbezogenen Veröffentlichungen gab (Tabelle 1).

Von den 25 Medikamenten hemmten 6 die Zellinvasion bei 0,1 μM um mehr als 50 %, darunter Nifuratel, Mitomycin C, Nitazoxanid, Ronidazol, Retapamulin und Furagin (Abb. 1d, Tabelle 1). Von den sechs Arzneimitteln wurden Mitomycin C und Ronidazol für weitere Studien ausgeschlossen, da ersteres häufig zur Behandlung von Krebs und Krebsmetastasen eingesetzt wird, während es sich bei letzterem um ein Antiprotozoenmittel handelt, das in der Veterinärmedizin eingesetzt, aber nicht für die Anwendung beim Menschen zugelassen ist. Für die verbleibenden 4 Medikamente haben wir die Abtötungsspezifität und die IC50-Werte in PC-3- und DU 145-Prostatakrebszellen, die KLF5, KLF5K369Q und KLF5K369Q exprimieren, mithilfe des CCK-8-Assays bestimmt. Nur Nitazoxanid (NTZ) der 4 Arzneimittel zeigte einen relativ geringeren IC50-Wert auf KLF5K369Q-exprimierenden Zellen als auf KLF5- und KLF5K369R-exprimierenden Zellen (Tabelle 2). NTZ war auch bei der Invasionshemmung bei der Expression von KLF5K369Q wirksamer als KLF5-exprimierende Zellen (zusätzliche Datei 1: Abb. S2a, S2b). Daher wurde NTZ für weitere Analysen ausgewählt.

Mit dem CCK-8-Assay wurde ein breiterer Bereich von NTZ-Konzentrationen auf ihre Wirkung auf PC-3-KQ- und DU 145-KQ-Zellen getestet. Wie in den Abb. gezeigt. S3a und S3b, NTZ hatten keinen Einfluss auf die Zellzahl bei niedrigeren Konzentrationen (0–0,1 μM), verringerten jedoch die Zellzahl bei höheren Konzentrationen. Im Koloniebildungstest reduzierte NTZ die Koloniezahl mit höheren Konzentrationen (Zusatzdatei 1: Abb. S3c-S3f).

Sowohl Präventions- als auch Therapiemodi wurden verwendet, um festzustellen, ob NTZ die Ac-KLF5-induzierte Knochenmetastasierung hemmt. Im Präventionsmodus (Abb. 2a) wurden Prostatakrebszellen, die die Ac-KLF5-nachahmende KLF5K369Q-Mutante (d. h. PC-3-KQ-Luc) exprimierten, nach einem kürzlich beschriebenen Verfahren über die Schwanzarterie im Schwanz in Mäuse injiziert [26]. ]. Fünf Wochen nach der Zellinjektion war bei PC-3-KQ-Luc-Zellen eine Knochenmetastasierung erkennbar, da die Biolumineszenzintensität laut einem Pilotexperiment recht stark war (Daten nicht gezeigt).

Nitazoxanid übt eine vorbeugende Wirkung auf die Ac-KLF5-induzierte Knochenmetastasierung in Prostatakrebszellen aus. ein Diagramm der experimentellen Zeitleiste. Am Tag 0 wurden Mäusen Krebszellen (PC-3-KQ-Luc oder PC-3-KR-Luc) über die Schwanzschwanzarterie injiziert, während Nitazoxanid über intragastrische Verabreichung verabreicht wurde. Biolumineszenzintensitäten wurden am Tag 35 gemessen. b, c Biolumineszenzbilder (links) von Mäusen, die PC-3-KQ-Zellen (b) oder PC-3-KR-Zellen (c) trugen und Nitazoxanid (NTZ) oder die Lösungsmittelkontrolle (Vehikel) erhielten ). Biolumineszenzintensitäten werden durch den Photonenfluss der Region of Interest (ROI) angezeigt (rechtes Feld, jeder Punkt stellt ein Bein einer Maus dar). n = 12 Beine/Gruppe. d Die Behandlung mit Nitazoxanid reduzierte die von PC-3-KQ-Zellen gebildeten Knochentumorbereiche signifikant, während sie die von PC-3-KR-Zellen nicht beeinträchtigte. Femurschnitte wurden mit H&E gefärbt und Bereiche mit Tumorzellen sowie ganze Knochenabschnitte wurden gemessen und zwischen der NTZ-Behandlung und der Kontrollgruppe verglichen. Auf der linken Seite werden repräsentative Bilder und auf der rechten Seite statistische Ergebnisse angezeigt. n = 6 Tumoren für jede Gruppe. B, trabekuläre Knochenregionen; BM, Knochenmarksregionen; T, Tumorregionen. Maßstabsbalken, 100 μm. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. **p < 0,01; ***, p < 0,001; ns, nicht signifikant unterschiedlich; wie durch den T-Test des Schülers geschätzt

In diesem Modell reduzierte die Verabreichung von NTZ gleichzeitig mit der Injektion von Tumorzellen die Knochenmetastasierung drastisch, wie durch die Biolumineszenzsignale angezeigt (Abb. 2b). Unterdessen erzeugten PC-3-KR-Luc-Zellen viel schwächere Biolumineszenzsignale (Abb. 2c). NTZ hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Biolumineszenzintensität von PC-3-KR-Luc-Zellen (Abb. 2c). Die Knochenhistomorphometrie von Knochengewebeschnitten ergab, dass NTZ die Tumorzellfläche bei Mäusen mit PC-3-KQ-Luc-Zellen signifikant verringerte (Abb. 2d). Im Gegensatz dazu hatten Mäuse mit PC-3-KR-Luc-Zellen viel kleinere Tumorbereiche, die durch NTZ nicht signifikant beeinflusst wurden (Abb. 2d).

Das Körpergewicht der mit NTZ behandelten Mäuse zeigte nach 5 Wochen in keiner der Gruppen eine merkliche Veränderung (Zusatzdatei 1: Abb. S4a, S4b). Darüber hinaus kam es bei keiner Maus in einer mit NTZ behandelten Gruppe zu schweren unerwünschten Ereignissen, Mortalität oder auffälligen histopathologischen Veränderungen in Herz, Lunge, Leber, Milz und Niere (Zusatzdatei 1: Abb. S4c).

Im Therapiemodus durften in Mäuse injizierte PC-3-KQ-Luc-Zellen sieben Tage lang Knochenmetastasen entwickeln, bevor NTZ verabreicht wurde. 7 Tage nach der Zellinjektion waren bei den meisten Mäusen Biolumineszenzsignale erkennbar (Zusatzdatei 1: Abb. S5). Mäuse wurden entsprechend der Biolumineszenzsignalintensität der Mäuse in zwei Gruppen eingeteilt (Abb. 3a und Zusatzdatei 1: Abb. S5). Nach 4 Wochen NTZ-Behandlung wurden die Mäuse zur Analyse getötet. Ähnlich wie im präventiven Modus verringerte die NTZ-Behandlung die Biolumineszenzintensitäten stark (Abb. 3b). Die Mikro-CT-Analyse zeigte, dass in der Kontrollgruppe zwar Knochenläsionen erkennbar waren, die NTZ-Behandlung diese Läsionen jedoch deutlich reduzierte (Abb. 3c). Die quantitative Analyse der Knochenparameter ergab, dass NTZ BV/TV und Tb signifikant steigerte. N und Tb. Th senkte gleichzeitig Tb deutlich. Sp (Abb. 3d). Die Quantifizierung von H&E-Schnitten von Knochengewebe bestätigte, dass NTZ die Tumorfläche im Knochen signifikant reduzierte (Abb. 3e). Das Körpergewicht von Mäusen wurde durch NTZ nicht beeinflusst (Abb. 3f).

Die Behandlung mit Nitazoxanid hemmt die osteolytische Knochenmetastasierung von Prostatakrebs in einem Mausmodell. ein Diagramm des Experimentzeitplans. Nach der Injektion über die Schwanzarterie und vor der intragastrischen Injektion von NTZ (sechs Mäuse pro Gruppe) durften sich Tumorzellen 7 Tage lang ansiedeln und wachsen. b Biolumineszenzbilder (links) und Intensitäten (rechts) von Mäusen nach 28-tägiger Behandlung mit NTZ oder Vehikel. n = 12 Beine/Gruppe. c Repräsentative Mikro-CT-Bilder von Femuren und Tibias (links) und Mikro-CT-Mikrofotografien von Femuren (XZ rechts). Der weiße Pfeil weist auf die in der Femurmetaphyse gebildete Osteolyse hin, die nach der NTZ-Behandlung verschwand. d Quantifizierung mehrerer Parameter für die Knochenmikrostruktur, einschließlich Knochenvolumen pro Gewebevolumen (BV/TV, n = 6 Femuren für jede Gruppe), Trabekelzahl (Tb.N, n = 6 Femuren für jede Gruppe), Trabekelseparation (Tb. Sp, n = 6 Femuren in der Kontrollgruppe, n = 5 Femuren in der NTZ-Gruppe) und Trabekeldicke (Tb.Th, n = 4 Femuren in der Kontrollgruppe, n = 5 Femuren in der NTZ-Gruppe). e H&E-Färbung von Knochenschnitten, die Bereiche mit Tumorzellen (T), Knochen (B) und Knochenmark (BM) zeigt (links). Das Verhältnis von Tumorfläche zu Knochenfläche wurde für jede Maus berechnet und im Diagramm rechts dargestellt. Maßstabsbalken in H&E-Bildern, 100 μm. n = 4 Femuren in der Kontrollgruppe, n = 5 Femuren in der NTZ-Gruppe. f Körpergewichte von Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung mit NTZ oder Vehikel. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. **, p < 0,01; ***, p < 0,001; wie durch den Student-t-Test geschätzt. NTZ, Nitazoxanid

Die Differenzierung von Osteoklasten ist ein wesentlicher Mechanismus für Ac-KLF5, um Knochenmetastasen bei Prostatakrebs zu induzieren [23]. Um festzustellen, ob NTZ die Ac-KLF5-induzierte Osteoklastendifferenzierung abschwächt, haben wir zunächst die Zytotoxizität von NTZ in RAW264.7-Zellen getestet, einem Zelllinienmodell der Osteoklastendifferenzierung. Im CCK-8-Zelllebensfähigkeitstest zeigte NTZ nach 48-stündiger Behandlung keine nachweisbare Zytotoxizität in RAW264.7-Zellen bei Konzentrationen von weniger als 25 μM (Abb. 4a). Während der RANKL-induzierten Osteoklastendifferenzierung in RAW264.7-Zellen, die sieben Tage dauerte, verringerte die NTZ-Behandlung die Anzahl der mehrkernigen TRAP+-Zellen dosisabhängig (Abb. 4b, c). Selbst 6,25 und 12,5 μM NTZ, die in RAW264.7-Zellen keine Zytotoxizität verursachten (Abb. 4a), verringerten die Anzahl der mehrkernigen TRAP+-Zellen immer noch signifikant (Abb. 4c). Daher schwächt NTZ wahrscheinlich die Osteoklastendifferenzierung ab.

Nitazoxanid schwächt die Ac-KLF5-induzierte Osteoklastendifferenzierung ab. a Auswirkungen von NTZ in unterschiedlichen Konzentrationen auf die Lebensfähigkeit von RAW264.7-Zellen nach 48-stündiger Behandlung, bestimmt durch den CCK8-Assay. b, c NTZ hemmt die Differenzierung von Osteoklasten in dosisabhängiger Weise, wie durch die TRAP-Färbung von RAW264.7-Zellen bestimmt, die 5 Tage lang mit RANKL (50 ng/ml) und verschiedenen NTZ-Konzentrationen behandelt wurden. Gezeigt werden repräsentative Bilder von TRAP+- und mehrkernigen Zellen (Kerne >3) (b) und deren Anzahl pro Vertiefung (c). An den Daten wurde eine einfaktorielle ANOVA-Analyse durchgeführt. d NTZ hemmte die durch konditioniertes Medium (CM) verursachte Osteoklastendifferenzierung von RAW264.7-Zellen aus PC-3-KQ-Zellen, wie durch repräsentative Bilder von TRAP-gefärbten Zellen (links) und die Anzahl der TRAP+-Zellen pro Vertiefung (rechts) danach angezeigt wird NTZ-Behandlungen. An den Daten wurde eine einfaktorielle ANOVA-Analyse durchgeführt. e NTZ hemmte die Osteoklastendifferenzierung von RAW264.7-Zellen, die mit PC-3-KQ-Zellen kokultiviert wurden, wie repräsentative Bilder von TRAP-gefärbten Zellen (links) und die Anzahl der TRAP+-Zellen pro Vertiefung (rechts) nach NTZ-Behandlungen zeigen. An den Daten wurde eine einfaktorielle ANOVA-Analyse durchgeführt. f NTZ verringerte die Anzahl der Ac-KLF5-induzierten Osteoklasten in Mausknochen, wie aus Bildern von Knochenabschnitten mit TRAP+-Zellen (links) und der Anzahl der Osteoklasten (N.Oc) pro mm Knochenoberfläche (BS) hervorgeht. Maßstabsbalken, 200 μm. Der Student-T-Test wurde durchgeführt. n = 5 Femuren in der Fahrzeuggruppe, n = 5 Femuren in der NTZ-Gruppe. Für alle Balkendiagramme werden die Daten als Mittelwert ± SD angezeigt. **, p < 0,01; ***, p < 0,001. T, Tumorzellen; B, Knochen; BM, Knochenmark; NTZ, Nitazoxanid; RANKL, Rezeptoraktivator des Kernfaktor-κB-Liganden; TRAP, Tartrat-resistente saure Phosphatase

Wir sammelten auch konditionierte Medien (CM) von PC-3-KQ-Zellen, die 36 Stunden lang mit NTZ in unterschiedlichen Konzentrationen (0, 1,25, 2,5 und 5 μM) behandelt wurden, und verwendeten das CM zur Behandlung von RAW264.7-Zellen in Gegenwart von a stärker verdünntes RANKL (10 ng/ml) für 7 Tage. Die Anzahl der mehrkernigen TRAP+-Zellen wurde durch CM aus Zellen, die mit NTZ bei 2,5 oder 5 μM behandelt wurden, signifikant reduziert (Abb. 4d).

Das dritte Modell für Ac-KLF5-induzierte Osteoklasten war die Co-Kultur von RAW264.7-Zellen mit PC-3-KQ-Zellen in Gegenwart von NTZ (0, 1,25, 2,5 und 5 μM) für 7 Tage und das anschließende TRAP Fleckenbildung. Die Co-Kultur nahm signifikant zu, während die NTZ-Behandlung bei allen drei Konzentrationen die Anzahl der mehrkernigen TRAP+-Zellen signifikant verringerte (Abb. 4e). In Mäusefemuren zeigte die TRAP-Färbung, dass die NTZ-Behandlung die Anzahl der TRAP+-Zellen im Vergleich zur Vehikelgruppe signifikant reduzierte (Abb. 4f).

MMP9 ist entscheidend für die PCa-Metastasierung [32], einschließlich der Knochenresorption während der Knochenmetastasierung [33]. Wir fanden heraus, dass das Ac-KLF55-nachahmende KLF5K369Q die MMP9-Expression sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Ebene im Vergleich zu KLF5K369R mit Acetylierungsmangel signifikant induzierte (zusätzliche Datei 1: Abb. S6a, S6b) und dass NTZ die MMP9-Expression dosisabhängig verringerte KLF5K369Q-exprimierende Zellen (Zusatzdatei 1: Abb. S6a, S6b). Die Abnahme der MMP9-Proteinexpression durch NTZ wurde in KLF5k369Q-induzierten Knochenmetastasen durch immunhistochemische Färbung bestätigt (Zusatzdatei 1: Abb. S6c). Daher kann die NTZ-vermittelte Hemmung der Knochenmetastasierung auch die Herunterregulierung von MMP9 durch NTZ beinhalten.

Um zu verstehen, wie NTZ KLF5K369Q-induzierte Knochenmetastasen unterdrückt, wurde eine RNA-Sequenzierung unter Verwendung von PC-3-KQ- und PC-3-KR-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von NTZ (5 μM) durchgeführt. Wir konzentrierten uns auf die Gene, deren Expressionsmuster durch KLF5K369Q moduliert wurden, aber die Modulation von KLF5K369Q wurde durch NTZ-Behandlung umgekehrt. Insgesamt gab es 2836 unterschiedlich exprimierte Gene zwischen KLF5K369Q und KLF5K369R, wobei 1779 durch KLF5K369Q hochreguliert und 1057 herunterreguliert wurden (Abb. 5a). KLF5K369Q-modulierte Expressionsmuster wurden durch NTZ-Behandlung für 241 von 2836 unterschiedlich exprimierten Genen umgekehrt. Zu den 241 Genen gehörten 127 durch KLF5K369Q hochregulierte und 114 herunterregulierte Gene (Abb. 5b, c; Zusatzdatei 2: Tabelle S3, Tabelle S4).

Nitazoxanid kehrt die Wirkung von Ac-KLF5 auf die Expression vieler Gene in PC-3-Zellen um. a Vulkandiagramme aller quantifizierten Gene aus den Genexpressionsprofilen zwischen KLF5K369Q und KLF5K369R in PC-3-Zellen. b Streudiagramm der differentiell exprimierten Gene (DEGs) zwischen PC-3-KQ-Zellen mit und ohne NTZ-Behandlung und DEGs zwischen PC-3-KQ- und PC-3-KR-Zellen. Punkte im oberen linken Quadranten stellen Gene dar, die durch KLF5K369Q herunterreguliert, aber durch NTZ hochreguliert wurden, während Punkte im unteren rechten Quadranten Gene anzeigen, die durch KLF5K369Q hochreguliert, aber durch NTZ in PC-3-Zellen herunterreguliert wurden. Zur Definition aller veränderten Gene wurde ein angepasster p-Wert <0,05 verwendet. c Heatmap mit DEGs im oberen linken und unteren rechten Quadranten von Panel A. Der Farbbalken rechts zeigt log2-fache Änderungen an (Log2FC).

Wir haben die 241 KLF5K369Q-modulierten und NTZ-responsiven Gene anhand der SU2C-Datenbank auf den Zusammenhang ihrer Expressionsniveaus mit dem Patientenüberleben bei Prostatakrebs untersucht. Überlebensdaten waren für 119 der 127 KLF5K369Q-herunterregulierten und NTZ-herunterregulierten Gene und 111 der 114 KLF5K369Q-herunterregulierten und NTZ-herunterregulierten Gene verfügbar (Zusatzdatei 2: Tabelle S5). Von den 119 KLF5K369Q-hochregulierten und NTZ-herunterregulierten Genen war nur die Hochregulierung von MYBL2 und TIMM8A signifikant mit einem schlechteren OS des Patienten verbunden (Abb. 6a), ein Muster, das mit der Metastasierungsunterdrückungsfunktion von NTZ übereinstimmt. Die Hochregulierung von 5 Genen, darunter INHBB, COL4A6, CACNG8, PIANP und C2orf78, war signifikant mit einem besseren OS anstelle eines schlechteren OS verbunden (Zusatzdatei 1: Abb. S7a). Die Hochregulierung der verbleibenden 112 Gene hatte keinen signifikanten Einfluss auf das Überleben des Patienten (Zusatzdatei 2: Tabelle S5). Daher ist es wahrscheinlicher, dass MYBL2 und TIMM8A die Induktion von Knochenmetastasen durch Ac-KLF5 vermitteln.

Zusammenhang zwischen Ac-KLF5- und NTZ-responsiven Genen und dem Patientenüberleben. a Höhere Expressionsniveaus von 7 Genen korrelieren mit dem Gesamtüberleben (OS) bei Prostatakrebspatienten, wie durch die Kaplan-Meier-Analyse unter Verwendung des SU2C-Datensatzes bestimmt. b Die Expressionsniveaus von 7 auf Ac-KLF5 und NTZ reagierenden Genen wurden mithilfe des GSE21034-Datensatzes analysiert (29).

Im GSE21034-Datensatz waren Expressionsniveaus von MYBL2 und TIMM8A in Primärtumoren, viszeralen Metastasen und Knochenmetastasen von Prostatakrebs verfügbar [29]. Während sowohl MYBL2 als auch TIMM8A in Metastasen in höheren Konzentrationen exprimiert wurden als in Primärtumoren, wenn viszerale und Knochenmetastasen kombiniert wurden (Abb. 6b), zeigte nur MYBL2 eine signifikant höhere Expression in Knochenmetastasen als in Primärtumoren, wenn Knochenmetastasen separat analysiert wurden (zusätzlich). Datei 1: Abb. S7b).

Von den 111 KLF5K369Q-herunterregulierten und NTZ-hochregulierten Genen im SU2C-Datensatz waren höhere Spiegel von TMPRSS2, CALB1, SPOCK2, COL4A4 und COL4A3 signifikant mit einem besseren OS verbunden (zusätzliche Datei 1: Abb. 6a). Höhere Werte von 2 Genen (FTH1 und BDH1) waren jedoch mit einem schlechteren OS des Patienten verbunden (Zusatzdatei 1: Abb. S7a).

Wir haben weiter getestet, ob Ac-KLF5 MYBL2 und TIMM8A transkriptionell reguliert. In PC-3- und DU 145-Zellen, die unterschiedliche Formen von KLF5 exprimierten, ergab die quantitative RT-PCR, dass MYBL2 sowohl in PC-3- als auch in DU 145-Zellen signifikant durch KLF5K369Q induziert wurde, wohingegen die Induktion von TIMM8A nicht signifikant war (Abb. 7a; Zusätzlich). Datei 1: Abb. S8a). Als KLF5 durch siRNAs in PC-3-KQ-Zellen abgebaut wurde, war die Expression von MYBL2 sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene signifikant reduziert (Abb. 7b; Zusatzdatei 1: Abb. S8b, S8c). Kürzlich wurde gezeigt, dass MYBL2 die Metastasierung und Kastrationsresistenz von Prostatakrebs fördert [34]. Daher haben wir uns auf die transaktivierende Regulation von MYBL2 durch KLF5K369Q konzentriert.

Nitazoxanid schwächt die Hochregulierung der MYBL2-Expression durch Ac-KLF5 in Prostatakrebszellen ab. a Expression von MYBL2 und TIMM8A in PC-3- und DU 145-Zellen, die verschiedene Formen von KLF5 exprimieren, bestimmt mittels qPCR. C4-2B- und parentale PC-3-Zelllinien wurden als Kontrollen verwendet, und GAPDH wurde als Ladungskontrolle verwendet. Die statistische Analyse wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit mehreren Vergleichen durchgeführt. b Zellen wurden mit 50 nM siKLF5 gleichzeitig mit oder ohne NTZ-Behandlung (5 μM) für 24 Stunden transfiziert und dann mit Echtzeit-qPCR verarbeitet. Die statistische Analyse wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit mehreren Vergleichen durchgeführt. c NTZ regulierte die MYBL2-Expression in PC-3-KQ-Zellen und DU 145-KQ-Zellen auf mRNA-Ebene herunter, wie durch qPCR nachgewiesen. Die NTZ-Behandlungen erfolgten 48 Stunden lang in den angegebenen Konzentrationen. Die statistische Analyse wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit mehreren Vergleichen durchgeführt. Die d NTZ-Behandlung bei Mäusen reduzierte die MYBL2-Expression in PC-3-KQ-Knochenmetastasen, wie durch IHC-Färbung nachgewiesen und durch IHC-Bilder und Intensitäten der Färbesignale angezeigt. n = 5 Tumoren für jede Gruppe. Der Student-T-Test wurde durchgeführt. Maßstabsbalken, 200 μm. e Der MYBL2-Genpromotor enthielt mehrere potenzielle KLF5-Bindungsstellen, wie vom JASPAR-Programm vorhergesagt. f, g NTZ hatte unterschiedliche Auswirkungen auf die Bindung von Ac-KLF5 an verschiedene Ac-KLF5-Bindungsstellen des MYBL2-Genpromotors, wie durch ChIP und reguläre RT-PCR (f) oder Echtzeit-qPCR (g) mittels PC bestimmt -3-KQ-Zellen, die 48 Stunden lang mit NTZ behandelt wurden, und PC-3-KR-Zellen. Alle Balkendiagramme werden als Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten angezeigt. *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001; ns, keine statistische Signifikanz

Sowohl in PC-3- als auch in DU 145-Zellen, die KLF5K369Q exprimieren, reduzierte die NTZ-Behandlung die Expression von MYBL2 sowohl auf mRNA als auch auf Protein in dosis- oder zeitabhängiger Weise (Abb. 7c; Zusatzdatei 1: Abb. S8d, Abb. S8e). . Wie durch immunhistochemische Färbung gezeigt wurde, verringerte die NTZ-Behandlung bei Mäusen auch die MYBL2-Proteinexpression im Knochengewebe signifikant (Abb. 7d).

Um die Wirkung von NTZ auf die Ac-KLF5-induzierte Transkription von MYBL2 weiter zu testen, analysierten wir die Promotorsequenz von MYBL2 mithilfe der Jaspar-Software, um potenzielle KLF5-Bindungsstellen zu identifizieren (Abb. 7e) und führten eine ChIP-PCR mit Primern durch, die das 6-Potential abdecken KLF5-Bindungsstellen mit den höchsten Bindungswerten. Für die 5 potenziellen Bindungsstellen zwischen –80 und –130 Nukleotiden wurde unter Verwendung von 2 Primerpaaren keine offensichtliche Bindung festgestellt (Abb. 7f). Für die mögliche Bindungsstelle zwischen -1242 und -1251 Nukleotiden ergab CHIP-PCR eine offensichtliche Besetzung von KLF5K369Q, nicht jedoch von KLF5K369R auf dem MYBL2-Promotor. Die NTZ-Behandlung verringerte die an KLF5K369Q gebundene DNA signifikant (Abb. 7f und g).

Wir haben mithilfe verschiedener Tests getestet, ob NTZ direkt an das KLF5-Protein bindet (Abb. 8). Im Fluoreszenzlöschungstest reduzierte NTZ die Fluoreszenzintensität von KLF5, KLF5K369Q und KLF5K369R dosisabhängig (Abb. 8a) mit einer Bindungskonstante Kd von 7,2, 5,4 bzw. 7,3 μM (Abb. 8b). . In der CD-Spektroskopie zeigten alle drei Formen von KLF5 negative Peaks zwischen 205 nm und 220 nm, was auf Veränderungen in der Sekundärstruktur eines Proteins hinweist [35]. Die NTZ-Behandlung verringerte die Intensität dieser negativen Peaks, ohne die Spektralform zu verändern (Abb. 8c), was auf einen Verlust der α-Helix-Strukturen schließen lässt. Die HPLC-Analyse bestätigte auch, dass NTZ unabhängig vom KLF5-Acetylierungsstatus an das KLF5-Protein bindet (Abb. 8d).

NTZ bindet unabhängig von seinem Acetylierungsstatus an das KLF5-Protein. a Fluoreszenzintensitäten der Proteine ​​KLF5, KLF5K369Q und KLF5K369R wurden nach Inkubation mit unterschiedlichen NTZ-Konzentrationen gemessen. b Berechnung der Kd-Werte für die Dissoziationskonstante mithilfe der Origin-Software und durch Anpassung der Fluoreszenzlöschungsdaten. c Zirkulardichroismus-Spektren (CD) von KLF5, KLF5K369Q und KLF5K369R, inkubiert mit NTZ. Die Konzentrationen sowohl der Proteine ​​als auch der NTZ betragen 0,2 μM. d Bindung von NTZ an die gereinigten verschiedenen Formen von KLF5-Proteinen mittels HPLC-Analyse

In diesen Arzneimittel-Protein-Bindungstests verwendeten wir das synthetische Retinoid Am80 als Negativkontrolle, da Am80 an RARα bindet, um seine Assoziation mit KLF5 bei der Genregulation zu fördern, ohne direkt an KLF5 zu binden [36]. Am80 band im Fluoreszenzlöschungstest an keine Form des KLF5-Proteins, da der Kd größer als 30 μM war (Zusatzdatei 1: Abb. S9a und S9b). Auch Am80 veränderte die Sekundärstruktur von KLF5 unabhängig von der NTZ-Behandlung nicht (Zusatzdatei 1: Abb. S9c).

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass Nitazoxanid (NTZ), ein derzeit zur Behandlung von parasitären und viralen Infektionen zugelassenes Medikament [37, 38], ein potenzielles therapeutisches Mittel zur Behandlung von PCa-Knochenmetastasen ist. Der direkte Beweis für diese Schlussfolgerung stammt aus den Tierversuchen, bei denen die NTZ-Behandlung die Bildung von Knochenmetastasen in einem etablierten Mausmodell, dh der KLF5K369Q-induzierten Knochenmetastasierung, drastisch unterdrückte (Abb. 2 und 3). Die Hemmung der Knochenmetastasierung war sowohl im präventiven als auch im therapeutischen Modus wirksam, da ähnliche Wirksamkeiten beobachtet wurden, wenn NTZ gleichzeitig mit der Zellinokulation (Abb. 2) oder eine Woche danach (Abb. 3) verabreicht wurde.

Krebserkrankungen der Prostata, der Brust und der Lunge metastasieren häufig in den Knochen [39,40,41]. Während bei Brust- und Lungenkrebs meist osteolytische Metastasen auftreten, verursacht Prostatakrebs sowohl osteolytische als auch osteoblastische Läsionen [39,40,41]. Verschiedene Faktoren beeinflussen das Gleichgewicht zwischen proosteoklastischen und proosteoblastischen Aktivitäten von Prostatakrebszellen [40, 41]. Beispielsweise sezernieren Prostatakrebszellen in der Knochenmikroumgebung knochenbezogene lösliche Faktoren wie RANKL und M-CSF, um Osteoklasten zu aktivieren; und Osteoklasten wiederum setzen TGF-β und IGF-1 frei, um das Wachstum von Prostatakrebszellen zu unterstützen [40, 41]. Darüber hinaus setzen Osteoklasten osteolytische Faktoren wie Parathyroidhormon-verwandtes Peptid (PTHrP) frei, um die Differenzierung und das Überleben der Osteoblasten zu fördern [39, 40]. Daher spielt die Osteoklastendifferenzierung eine wichtige Rolle bei der Knochenmetastasierung von Prostatakrebs, und die Hemmung der Osteoklastendifferenzierung kann die Knochenmetastasierung von Prostatakrebs wirksam abschwächen. Unsere vorherige Studie hat gezeigt, dass die Differenzierung von Osteoklasten ein zellulärer Mechanismus für KLF5K369Q ist, um osteolytische Knochenmetastasen bei Prostatakrebs zu induzieren [23]. Selbst in C4-2B-Zellen, die hauptsächlich osteoblastische Läsionen im Knochen fördern [42], verursachte die ektopische Expression von KLF5K369Q oder KLF5 immer noch osteolytische Knochenläsionen [23]. In Übereinstimmung mit seiner therapeutischen Wirkung auf Knochenmetastasen schwächte die NTZ-Behandlung tatsächlich die KLF5K369Q-induzierte Osteoklastendifferenzierung ab. Eine solche hemmende Wirkung wurde erstmals in einem In-vitro-Modell der Osteoklastendifferenzierung nachgewiesen, dh mit RAW264.7-Zellen, die mit RANKL behandelt oder mit KLF5K369Q-exprimierenden Krebszellen kokultiviert wurden (Abb. 4b – e). Die hemmende Wirkung von NTZ auf Osteoklasten wurde auch im Mausmodell bestätigt (Abb. 4f). Es ist erwähnenswert, dass NTZ selbst bei Konzentrationen, die keine Zytotoxizität gegenüber RAW264.7-Zellen zeigten (Abb. 4a), die Osteoklasten immer noch verringerte (Abb. 4b, c). Angesichts der Tatsache, dass Prostatakrebs häufiger osteoblastische Läsionen hervorruft, ist es sinnvoll zu untersuchen, ob NTZ auch die Differenzierung und Funktion von Osteoblasten hemmt.

Die Hemmung der KLF5K369Q-induzierten Osteoklastendifferenzierung in vitro und in vivo steht im Einklang mit einer aktuellen Studie, in der NTZ den Knochenverlust bei ovarektomierten Mäusen durch Hemmung der RANKL-induzierten Osteoklastogenese reduziert [43].

Auf molekularer Ebene scheint NTZ die Funktion von KLF5K369Q bei der Gentranskription bei der Hemmung der Knochenmetastasierung direkt zu modulieren. KLF5 ist ein Transkriptionsfaktor, und die KLF5K369Q-vermittelte Knochenmetastasierung wird durch eine Reihe von Genen vermittelt, die durch KLF5K369Q transkriptionell reguliert werden, darunter CXCR4, IL11 und andere (23). KLF5K369Q regulierte 2836 Gene im Vergleich zu KLF5K369R hoch oder herunter (Abb. 5a). Die NTZ-Behandlung kehrte die Hoch- oder Herunterregulierung von 241 Genen durch KLF5K369Q um (Abb. 5b, c; Zusatzdatei 2: Tabelle S3, Tabelle S4). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass NTZ die Funktion von KLF5K369Q bei der Transkription vieler Gene verändert.

Mehrere Gene könnten die Wirkung von NTZ auf die KLF5K369Q-vermittelte Knochenmetastasierung vermitteln. Beispielsweise wurden zwei durch Ac-KLF5 hochregulierte und NTZ-herunterregulierte Gene, MYBL2 und TIMM8A, bei menschlichem Prostatakrebs hochreguliert. Ihre Hochregulierung war signifikant mit einem schlechteren Gesamtüberleben bei Patienten mit Prostatakrebs verbunden (Abb. 6a). Es gab auch 5 KLF5K369Q-herunterregulierte und NTZ-hochregulierte Gene, deren niedrigere Expressionsniveaus bei menschlichen Prostatakrebserkrankungen ebenfalls signifikant mit einem schlechteren Gesamtüberleben verbunden waren, darunter TMPRSS2, CALB1, SPOCK2, COL4A4 und COL4A3 (Abb. 6a). Diese 7 Gene könnten zusätzlich zu CXCR4 und IL11, die in einer früheren Studie beschrieben wurden, eher einen Einfluss auf die fördernde Rolle von KLF5K369Q bei der Knochenmetastasierung haben [23].

Unter den 7 KLF5K369Q-regulierten und NTZ-responsiven Genen ist das MYBL2 (Myb-verwandtes Protein B) besonders interessant, da eine frühere Studie gezeigt hat, dass MYBL2 das kastrationsresistente Wachstum und die Knochenmetastasierung von Prostatakrebs fördert [34]. Darüber hinaus blockiert die gezielte Behandlung von MYBL2 die Knochenmetastasierung in Prostatakrebszellen, und höhere MYBL2-Expressionsniveaus sind mit einem höheren Tumorstadium, einem höheren Tumorgrad, einem höheren Risiko eines metastasierten Rückfalls und einer schlechteren Prognose bei Patienten mit Prostatakrebs verbunden [34]. MYBL2 reguliert das Fortschreiten des Zellzyklus, das Überleben und die Differenzierung in Krebszellen [44]. Wir fanden heraus, dass das MYBL2-Gen tatsächlich durch KLF5K369Q in Prostatakrebszellen transkriptionell aktiviert wurde. Beispielsweise wurde KLF5K369Q hochreguliert, während seine Stummschaltung die MYBL2-Expression reduzierte, und KLF5K369Q band an bestimmte Sequenzen des MYBL2-Promotors, um seine Transkription zu aktivieren, während KLF5K369R dies nicht tat (Abb. 7; Zusatzdatei 1: Abb. S8). Darüber hinaus verringerte die NTZ-Behandlung die Expression von MYBL2 sowohl in kultivierten Zellen als auch in in Mäusen gezüchteten Tumoren und beeinträchtigte die Bindung von KLF5K369Q an den MYBL2-Promotor (Abb. 7).

Erwähnenswert ist auch, dass KLF5K369Q die MMP9-Expression hochregulierte und die Hochregulierung durch NTZ-Behandlung abgeschwächt wurde (Zusatzdatei 2: Tabelle S4; Zusatzdatei 1: Abb. S6). Aktivierte Osteoklasten produzieren Säure und Proteinasen wie Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), um die Knochenmatrix abzubauen und so mehr TGF-β und andere Wachstumsfaktoren im Knochen freizusetzen. Solche Faktoren wiederum stimulieren die Knochenmetastasierung, wodurch der sogenannte Teufelskreis entsteht [45]. Die Hemmung der MMP9-Expression durch NTZ in KLF5K369Q-exprimierenden Zellen könnte somit auch zur Hemmung der Knochenmetastasierung durch NTZ beitragen.

NTZ scheint direkt auf das KLF5-Protein einzuwirken und dessen Funktionen zu modulieren, wie verschiedene Arzneimittel-Protein-Bindungstests zeigen (Abb. 8). Während NTZ an das KLF5-Molekül bindet, scheint die Bindung nicht spezifisch für KLF5K369Q zu sein, da KLF5 und KLF5K369R ebenfalls ähnliche Bindungskapazitäten zeigten (Abb. 8). Es muss noch geklärt werden, wie NTZ auf KLF5 wirkt und ob sich eine solche Wirkung direkt auf die Funktion von KLF5 bei der Gentranskription auswirkt.

Die hemmende Wirkung von NTZ auf die Knochenmetastasierung könnte auf andere Arten von bösartigen Erkrankungen zutreffen, bei denen Knochenmetastasen häufig auftreten und TGF-β ein Auslöser ist, einschließlich Brust-, Lungen- und Prostatakarzinomen sowie multiplem Myelom [46, 47]. Wir haben zuvor berichtet, dass TGF-β die Acetylierung von KLF5 in Epithelzellen induziert und dass die Acetylierung von KLF5 für TGF-β wesentlich ist, um die Genexpression und mehrere zelluläre Prozesse wie Zellproliferation und EMT zu regulieren (17, 18, 20, 23, 48). ]. Die Ac-KLF5-nachahmende KLF5K369Q-Mutante hält die EMT aufrecht, fördert die Zellinvasion und induziert Knochenmetastasen in Prostatakrebszellen [23]. Daher sollte die in dieser Studie festgestellte therapeutische Wirkung von NTZ auf KLF5K369Q-induzierte Knochenmetastasen auch für TGF-β-induzierte Knochenmetastasen bei anderen Arten von bösartigen Erkrankungen gelten.

Andere Medikamente, die im Zellsphäroidinvasionstest ebenfalls die Invasion von KLF5K369Q-exprimierenden Zellen unterdrückten, könnten ebenfalls in der Lage sein, Knochenmetastasen zu unterdrücken. Die Screening-Strategie wurde von Cribbes et al. entwickelt. zuvor [24]. Die Entdeckung der unterdrückenden Aktivität von NTZ bei Knochenmetastasen bestätigt diese Screening-Strategie mit KLF5K369Q-exprimierenden Zellen (Abb. 1). Zusätzlich zu NTZ hemmten auch fünf weitere Medikamente die Zellsphäroidinvasion um mehr als 50 % bei 0,1 μM. Dazu gehörten Nifuratel, Mitomycin C, Ronidazol, Retapamulin und Furagin (Abb. 1d, Tabelle 1). Während Mitomycin C häufig bei der Behandlung von Metastasen eingesetzt wird [49, 50] und Ronidazol als veterinärmedizinisches Mittel fungiert, wurde in der Literatur keines der verbleibenden drei Arzneimittel mit der Krebsmetastasierung in Verbindung gebracht. Es lohnt sich daher, diese drei Medikamente auf ihre mögliche therapeutische Rolle bei Knochenmetastasen zu testen.

NTZ ist für die Behandlung verschiedener Infektionskrankheiten zugelassen, darunter Protozoen-, Anthelminthika-, Virus- und bakterielle Infektionen [51]. Obwohl unsere Studie die erste ist, die eine therapeutische Wirkung von NTZ auf die Knochenmetastasierung von Prostatakrebs nachweist, wurde in jüngsten Studien über seine krebshemmende Wirkung bei verschiedenen Krebsarten berichtet, an denen verschiedene molekulare Mechanismen beteiligt sind. Beispielsweise unterdrückte es das Wachstum von Dickdarmtumoren, wahrscheinlich indem es einen Stillstand des Zellzyklus induzierte und die Expression mehrerer Moleküle veränderte [52, 53]; es unterdrückte das Wachstum von Eierstockkrebs teilweise durch Hemmung der Aktivität der Proteindisulfidisomerase (PDI) [54]; es hemmte die Kugelbildung in 3D-Kulturen von HCC- und CRC-Zellen, was die Hemmung von OXPHOS mit sich brachte [55, 56]; und es unterdrückte das Gliomwachstum, indem es den Stillstand des G2/M-Zellzyklus verursachte, Apoptose induzierte und die Autophagie hemmte, wahrscheinlich durch CDK1-Hemmung, ING1-Hochregulierung usw. [57, 58]. NTZ könnte auch die Induktion von Brusttumoren durch MNU bei Ratten verhindern [59].

Auf molekularer Ebene deuten frühere Studien darauf hin, dass NTZ die Funktionen mehrerer Moleküle beeinflussen und verschiedene Signalwege modulieren könnte [51]. Beispielsweise wurde NTZ mithilfe eines HTS-Screeningsystems als MYC-Inhibitor in Brustkrebszellen identifiziert [60]; NTZ könnte als moderater Inhibitor des STAT3-Signalwegs wirken [61]; Die Hemmung der Wnt-Signalaktivität durch NTZ könnte unabhängig von APC erfolgen, beinhaltet jedoch das Targeting von PAD2 und die anschließende Erhöhung der Desaminierung und des Umsatzes von β-Catenin in Dickdarmkrebszellen [62]. Bioinformatische Analysen legen nahe, dass NTZ in HCC-Zellen auf viele Moleküle, biologische Prozesse und Signalwege abzielen könnte [63]. Die Auslösung des Zelltods durch NTZ und einige seiner Derivate beinhaltet auch das Angreifen des 20S-Proteasoms [64].

Zusammenfassend haben wir den kürzlich entwickelten Sphäroid-Invasion-Screening-Assay übernommen, um von der FDA zugelassene Medikamente zu identifizieren, die auf durch acetyliertes KLF5 induzierte Knochenmetastasen bei Prostatakrebs abzielen. Sechs der Medikamente von 1987 hemmten die Invasion von Zellsphäroiden bei 0,1 μM um mehr als 50 %. Dazu gehörten Nitazoxanid, Nifuratel, Mitomycin C, Ronidazol, Retapamulin und Furagin. Funktionelle Experimente ergaben, dass NTZ die KLF5K369Q-induzierte Knochenmetastasierung bei Mäusen sowohl im präventiven als auch im therapeutischen Modus unterdrückte. NTZ hemmte die Osteoklastogenese, einen zellulären Prozess, der für die KLF5K369Q-induzierte Knochenmetastasierung verantwortlich ist. Mechanistisch gesehen band NTZ an das KLF5-Molekül und kehrte die Funktion von KLF5K369Q bei der Transkription vieler Gene um. Zwei KLF5K369Q-hochregulierte und NTZ-herunterregulierte Gene, MYBL2 und TIMM8A, waren bei menschlichem Prostatakrebs hochreguliert, und die Hochregulierung war mit einem schlechteren Patientenüberleben verbunden. Die Hochregulierung von MYBL2 durch KLF5K369Q beinhaltete eine direkte Promotorbindung, und NTZ schwächte die Bindung ab. Diese Ergebnisse stellen NTZ als potenzielles Therapeutikum für die durch Ac-KLF5 induzierte Knochenmetastasierung bei Prostatakrebs dar.

Daten, die diese Studie unterstützen, einschließlich der Ergebnisse des Verbindungsbibliothek-Screenings und der Ergebnisse der RNA-Sequenzierungsanalyse, sind in den ergänzenden Datendateien enthalten. Der während der aktuellen Studie analysierte Datensatz ist über das NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)-Repository mit der Zugangsnummer verfügbar. GSE21034, https://identifiers.org/geo:GSE21034. Die Rohsequenzdaten dieser Studie wurden im GEO mit der Zugangsnummer GSE216126 hinterlegt und der Weblink für diese Studie lautet https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/?term=GSE216126.

Krüppelartiger Faktor 5

Acetyliertes KLF5

Acetyliertes KLF5

Deacetyliertes KLF5

Prostatakrebs

Metastasierter kastrationsresistenter Prostatakrebs

Transformierender Wachstumsfaktor-β

Epithel-mesenchymale Transformation

Dimethylsulfoxid

Lebensmittel- und Arzneimittelbehörde

Nitazoxanid

Zellzählset-8

Natriumcarboxymethylcellulose

Rezeptoraktivator des Kernfaktors κB

Tartratresistente saure Phosphatase

Falscherkennungsrate

Stand Up to Cancer/Prostate Cancer Foundation

Skelettbezogene Ereignisse

Halbmaximale Hemmkonzentration

Optische Dichte

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Wir danken den Mitarbeitern des Laboratory Animal Center der Southern University of Science and Technology für die Unterstützung bei Tierstudien.

Diese Studie wird durch das Stipendium JCYJ20200109141229255 der Wissenschafts-, Technologie- und Innovationskommission der Stadt Shenzhen unterstützt.

Qingqing Huang und Mingcheng Liu trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit bei.

Abteilung für menschliche Zellbiologie und Genetik, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 1088 Xueyuan Blvd, Shenzhen, 518055, China

Qingqing Huang, Mingcheng Liu, Duo Zhang, Bing-Biao Lin, Xing Fu, Zhiqian Zhang, Baotong Zhang und Jin-Tang Dong

Abteilung für Urologie, Nieren- und Urologiezentrum, Zentrum für Beckenbodenstörungen, Siebtes angegliedertes Krankenhaus, Sun Yat-sen-Universität, Shenzhen, 518000, China

Bing-Biao Lin

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QH, ML und JTD haben die Experimente entworfen; QH und ML führten die meisten Experimente durch und DZ reinigte KLF5-Proteine ​​und half bei Arzneimittel-Protein-Wechselwirkungstests; QH analysierte die experimentellen Daten; BL und XF führten bioinformatische Analysen durch; QH, JTD, ML und BL haben das Manuskript geschrieben, überprüft und überarbeitet; BZ und ZZ halfen bei der Gestaltung einiger Experimente; und JTD konzipierten das Projekt, überwachten die Studie, lieferten allgemeine Leitlinien und stellten das Manuskript fertig. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Jin-Tang Dong.

Alle Mäuse wurden gemäß dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren gehalten und behandelt. Tierversuche wurden mit Genehmigung des Laboratory Animal Ethics Committee der Southern University of Science and Technology (Genehmigungsnummer: SUSTC-JY2019030-1) durchgeführt.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Vergleich der Migrations- und Invasionsfähigkeit zwischen verschiedenen Formen von KLF5-exprimierenden Zellen, bezogen auf Abb. 1. Abbildung S2. Die Wirkung von NTZ auf die Invasion acetylierter (KQ) und nicht mutierter KLF5-Zellen, bezogen auf Abb. 1. Abbildung S3. Die Wirkung von NTZ auf die Zellproliferation in acetylierten KLF5-exprimierenden Zellen, bezogen auf Abb. 1. Abbildung S4. NTZ verursachte in vivo keine merkliche Toxizität, siehe Abbildung 2. Abbildung S5. Represensitive BL-Bilder jeder Maus am Tag 7 (links) und BL-Intensitätsanalyse (rechts), bezogen auf Abb. 3. Abbildung S6. NTZ regulierte die acetylierte KLF5-induzierte MMP9-Expression herunter. Abbildung S7. Differenzielle Gene zwischen KQ-Ctrl- und KR-Ctrl-Gruppen und Gesamtüberlebensanalyse von 7 unterschiedlichen Genen, siehe Abb. 5 und Abb. 6. Abbildung S8. Nitazoxanid reduziert die durch acetyliertes KLF5 induzierte MYBL2-Produktion, bezogen auf Abb. 7. Abbildung S9. Am80 als Negativkontrolle bindet nicht an die Proteine ​​KLF5, KLF5K369Q und KLF5K369R, bezogen auf Abb. 8.

Sekundäres Drogenscreening von 87 Trefferverbindungen. Tabelle S2. Drittes Wirkstoffscreening von 25 erfolgreichen Wirkstoffen. Tabelle S3. Von NTZ betroffene differenzielle Gene in RNA-Seq. Tabelle S4. TPM von PC-3-Zellen mit KR und KQ in Gegenwart oder Abwesenheit von NTZ in RNA-Seq. Tabelle S5. Die Bedeutung des Gesamtüberlebens von NTZ-herunterregulierten Genen oder NTZ-hochregulierten Genen in der SU2C-Datenbank.

Die unbeschnittenen Immunblot- oder Gelbilder.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Huang, Q., Liu, M., Zhang, D. et al. Nitazoxanid hemmt die durch acetyliertes KLF5 induzierte Knochenmetastasierung, indem es die KLF5-Funktion bei Prostatakrebs moduliert. BMC Med 21, 68 (2023). https://doi.org/10.1186/s12916-023-02763-4

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Eingegangen: 26. Oktober 2022

Angenommen: 30. Januar 2023

Veröffentlicht: 21. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-023-02763-4

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