Vaccinia E5 ist ein wichtiger Inhibitor des DNA-Sensors cGAS

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 2898 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die zyklische GMP-AMP-Synthase (cGAS) des DNA-Sensors ist für die antivirale Immunität des Wirts von entscheidender Bedeutung. Das Vacciniavirus (VACV) ist ein großes zytoplasmatisches DNA-Virus, das zur Familie der Pockenviren gehört. Wie das Vacciniavirus den cGAS-vermittelten zytosolischen DNA-Sensorweg antagonisiert, ist nicht genau geklärt. In dieser Studie haben wir 80 Vaccinia-Gene gescreent, um potenzielle virale Inhibitoren des cGAS/Stimulator of Interferon Gene (STING)-Signalwegs zu identifizieren. Wir haben herausgefunden, dass Vaccinia E5 ein Virulenzfaktor und ein wichtiger Inhibitor von cGAS ist. E5 ist für die Unterbindung der cGAMP-Produktion während einer Infektion dendritischer Zellen mit dem Vaccinia-Virus (Stamm Western Reserve) verantwortlich. E5 lokalisiert sich im Zytoplasma und im Zellkern infizierter Zellen. Zytosolisches E5 löst durch Interaktion mit cGAS die Ubiquitinierung von cGAS und den Proteasom-abhängigen Abbau aus. Durch die Löschung des E5R-Gens aus dem Genom des modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) wird die IFN-Produktion vom Typ I durch dendritische Zellen (DCs) stark induziert, die DC-Reifung gefördert und dadurch die Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten verbessert.

Die zyklische GMP-AMP-Synthase (cGAS) ist ein wichtiger DNA-Sensor, der für die angeborene antivirale und tumorhemmende Immunität sowie bei entzündlichen Autoimmunerkrankungen von entscheidender Bedeutung ist1,2,3,4. Sobald cGAS durch zytosolische DNA aktiviert wird, erzeugt es zyklisches GMP-AMP (cGAMP), das wiederum an ein im endoplasmatischen Retikulum lokalisiertes Protein STING bindet, was zur Aktivierung des TBK1/IRF3/IFNB-Signalwegs führt. Folglich haben sich Viren so entwickelt, dass sie viele Strategien anwenden, um diesen wichtigen antiviralen Signalweg zu umgehen5,6,7,8.

Pockenviren sind große zytoplasmatische DNA-Viren, die wichtige menschliche und veterinärmedizinische Krankheitserreger sowie onkolytische Wirkstoffe und virale Vektoren sind9,10,11. Das Vaccinia-Virus (VACV) wurde erfolgreich als Impfstoff zur Ausrottung der Pocken eingesetzt. Eine direkte Infektion dendritischer Zellen (DCs) mit Vaccinia führt jedoch zur Hemmung sowohl der angeborenen als auch der adaptiven Immunantwort12,13,14. Das modifizierte Vaccinia-Virus Ankara (MVA) ist ein stark abgeschwächter Vaccinia-Stamm, bei dem nach mehr als 570 seriellen Passagen in Hühnerembryo-Fibroblasten große Fragmente aus seinem elterlichen Vaccinia-Genom gelöscht wurden, wodurch es in den meisten Säugetierzellen nicht replizierbar ist15,16. MVA ist ein wichtiger Impfstoffvektor und wurde kürzlich als Impfstoff der zweiten Generation gegen Pocken und Affenpocken zugelassen10,17.

cGAS ist wichtig für die Abwehr des Wirts gegen Pockenvirusinfektionen. cGAS-defiziente Mäuse sind anfälliger für eine intranasale Infektion mit VACV2 und für eine Fußballenimpfung mit dem Ektromeliavirus, einem mausspezifischen Pockenvirus18. Kürzlich wurde entdeckt, dass das B2R-Gen von Vaccinia eine zytosolische cGAMP-Nuklease (umbenannt in Poxin) kodiert, und die Löschung von B2R aus VACV führte zu einer Abschwächung im Hautskarifizierungsmodell (SS)19. Ob Pockenviren jedoch einen oder mehrere direkte Inhibitoren von cGAS kodieren, bleibt unbekannt.

In dieser Studie führten wir mit einem Dual-Luciferase-Reporter-Assay ein Screening von 80 Vaccinia-Virusgenen auf Hemmung des cGAS/STING-Signalwegs durch und identifizierten mehrere Vaccinia-Gene, die für Proteine ​​kodieren, die an der Herunterregulierung des cGAS/STING/IFNB-Signalwegs beteiligt sind. Hier zeigen wir, dass E5 (kodiert durch das E5R-Gen), ein in Orthopoxviren konserviertes Protein mit der BEN-Domäne20, ein Virulenzfaktor und ein wichtiger Inhibitor von cGAS ist. E5 interagiert mit zytoplasmatischem cGAS und löst dessen Abbau auf Proteasom-abhängige Weise aus.

Das Vaccinia-Virus ist ein großes zytoplasmatisches DNA-Virus mit einem Genom von 190 Kilobasenpaaren (kbp), das über 200 Proteine ​​kodiert21,22. MVA weist eine etwa 30 kbp große Deletion im elterlichen Vaccinia-Genom auf, was zum Verlust vieler immunmodulatorischer viraler Gene führt15. Eine MVA-Infektion von BMDCs induzierte die IFN-β-Sekretion und die cGAMP-Produktion, wohingegen eine Infektion mit dem Wildtyp-Vaccinia-Stamm WR (WT VACV) dies nicht bewirkte (Abb. 1a, b). Diese Ergebnisse legen nahe, dass WT-VACV möglicherweise einen oder mehrere virale Inhibitoren kodiert, um die cGAS-Aktivierung und die nachgeschaltete IFN-β-Produktion zu blockieren.

eine ELISA-Analyse der IFN-β-Spiegel in den Überständen von BMDCs, die 16 Stunden lang mit WT-VACV oder MVA bei einer MOI von 10 infiziert waren. Zelllysate wurden mittels Immunoblot analysiert. n = 3 unabhängige Stichproben. b cGAMP-Spiegel in BMDCs, die entweder mit WT-VACV oder MVA infiziert waren, bei einer MOI von 10. Die Zellen wurden 2 und 8 Stunden nach der Infektion geerntet. Die cGAMP-Spiegel wurden mittels LC-MS gemessen. c Immunoblot von cGAS, C7 und E3 in BMDCs von WT- oder cGas-/-Mäusen, die 16 Stunden lang mit verschiedenen Vacciniaviren bei einer MOI von 10 infiziert waren. d ELISA-Analyse der IFN-β-Spiegel in BMDCs von WT- oder cGas-/-Mäusen, die 16 Stunden lang mit verschiedenen Vacciniaviren bei einer MOI von 10 infiziert waren. n = 3 unabhängige Stichproben. e ELISA-Analyse der cGAMP-Spiegel in WT-BMDCs, die 16 Stunden lang mit WT-VACV oder VACVΔE5R bei einer MOI von 10 infiziert waren. n = 3 unabhängige Stichproben. Für den Vergleich zweier Gruppen in den Studien wurde der zweiseitige, ungepaarte Student-t-Test verwendet. Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente und werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um potenzielle cGAS-Inhibitoren aus dem Vaccinia-Genom zu identifizieren, haben wir zunächst 80 virale Gene ausgewählt, darunter hauptsächlich diejenigen, die zu frühen Zeitpunkten während der Vaccinia-Infektion exprimiert werden21, mit der Begründung, dass Antagonisten der angeborenen Immunität wahrscheinlich von viralen frühen Genen kodiert werden. Anschließend wurde ein Dual-Luciferase-Assay durchgeführt, um die Fähigkeit dieser viralen Proteine ​​zu untersuchen, den cGAS/STING-vermittelten zytosolischen DNA-Sensorweg zu hemmen. Ähnliche Strategien wurden erfolgreich zum Screening auf Inhibitoren dieses Signalwegs durch andere DNA-Viren eingesetzt, wie bereits berichtet5,23. In unserem System hatte die Transfektion von HEK293-T-Zellen mit 10 ng STING einen begrenzten IFNB-Promotor-Induktionseffekt, wohingegen die Transfektion mit 25 ng STING das IFNB-Glühwürmchen-Luciferase-Signal verstärkte, was darauf hindeutet, dass eine große Menge STING allein ohne cGAS ein Luciferase-Signal erzeugen könnte (ergänzende Abb. 1a). Daher verwendeten wir in unserem Screening die Kotransfektion von STING (10 ng) und cGAS (50 ng) mit der Absicht, potenzielle cGAS-Inhibitoren auszuwählen (ergänzende Abbildung 1b, c). Adenovirus E1A kodiert einen bekannten Inhibitor von STING6, und das Vaccinia-C7L-Gen wurde kürzlich von unserer Gruppe berichtet, dass es einen Inhibitor des IRF3/IFNB-Signalwegs kodiert, indem es die IRF3-Phosphorylierung verhindert24. Hier haben wir gezeigt, dass die Co-Transfektion von E1A oder C7L mit STING (10 ng) und cGAS (50 ng) zur Hemmung des IFNB-Glühwürmchen-Luciferase-Signals führte (ergänzende Abbildung 1b). Daher wurden sie als Positivkontrollen für das Screening ausgewählt. Für das eigentliche Screening wurden HEK293T-Zellen mit Plasmiden transfiziert, die einen IFNB-Firefly-Luciferase-Reporter, ein pRL-TK-Kontrollplasmid, das Renilla-Luciferase, cGAS (50 ng), STING (10 ng) und einzelne Vaccinia-Virusgene wie angegeben exprimierten sowie E1A und C7R (Ergänzende Abbildung 1c). Dieser Assay identifizierte mehrere frühe Gene des Vaccinia-Virus (E5R, K7R, B14R, C11R, WR199/B18R, WR200/B19R, E4L) als potenzielle Inhibitoren des cGAS/STING-Signalwegs (ergänzende Abb. 1c, d). Um zu testen, ob einer der Inhibitorkandidaten die STING-vermittelte Aktivierung des IFNB-Promotors abschwächt, haben wir einzelne Kandidatengene zusammen mit STING in einer höheren Menge (50 ng) co-transfiziert, was die Induktion des IFNB-Promotors ohne cGAS bewirkt. Wir fanden heraus, dass die Überexpression aller Kandidaten mit Ausnahme von B14R nur geringe Auswirkungen auf die durch STING (50 ng) induzierte IFNB-Promotoraktivität hatte, was darauf hindeutet, dass B14 möglicherweise auf STING oder seine nachgeschalteten Signalwege abzielt, während andere Kandidaten möglicherweise auf cGAS abzielen (ergänzende Abbildung 1e). ). Von diesen Genen ist bekannt, dass WR200/B19R ein IFN-bindendes Protein vom Typ I kodiert25. Obwohl K7, B14 und C11 als Vaccinia-Virulenzfaktoren26,27,28 beschrieben wurden und WR199/B18R Berichten zufolge einen Wirtsbereichsfaktor29,30 kodiert, ist unklar, wie sie den Typ-I-IFN-Signalweg umgehen. E4L kodiert für die Vaccinia-RNA-Polymerase-Untereinheit RPO30 und einen intermediären Transkriptionsfaktor31,32. Während berichtet wurde, dass E5 ein virales frühes Protein ist, das mit den Virosomen (Virusfabriken) assoziiert ist33, ist unbekannt, ob es eine Rolle bei der Immunumgehung spielt oder nicht.

Wir stellten die Hypothese auf, dass die Löschung eines wichtigen Inhibitors des cGAS/STING-Signalwegs aus dem VACV-Genom zu einer stärkeren Induktion von Typ-I-IFN führen würde als bei anderen Deletionsmutanten oder dem Elternvirus. Um diese Idee zu testen, haben wir eine Reihe rekombinanter VACV-Viren mit Deletionen einzelner viraler Inhibitorkandidaten generiert, darunter VACV∆E5R, VACV∆B2R, VACV∆E3L, VACV∆C11R, VACV∆WR199, VACV∆WR200, VACV∆K7R, und VACV∆C7L. WT- und cGAS-/- BMDCs wurden mit WT-VACV und den Deletionsmutanten infiziert. Die Expression der Virusproteine ​​C7 und E3 wurde bestimmt, um eine Virusinfektion zu verifizieren (Abb. 1c). Die IFN-β-Konzentrationen in den Überständen infizierter BMDCs wurden durch ELISA bestimmt. Eine WT-VACV-Infektion von BMDCs konnte die IFN-β-Produktion nicht induzieren. Von allen Deletionsmutanten induzierte nur VACV∆E5R die IFN-β-Sekretion von WT-BMDCs, nicht jedoch von cGAS-/- BMDCs (Abb. 1d). VACV∆E5R-E5R-Flag, in dem E5R durch E5R-Flag ersetzt wurde, konnte die IFN-β-Sekretion nicht induzieren, was bedeutet, dass E5R-Flag biologisch aktiv ist (Abb. 1d). Obwohl B2 (kodiert durch das B2R-Gen) als cGAMP-Nuklease 19 identifiziert wurde, induzierte die VACV∆B2R-Infektion darüber hinaus keine IFN-β-Sekretion aus WT-BMDCs (Abb. 1d), was auf das Vorhandensein anderer viraler Inhibitoren des cGAS/STING schließen lässt /IFNB-Weg in VACV∆B2R. Darüber hinaus induzierte die VACV∆E5R-Infektion von WT-BMDCs die cGAMP-Produktion, was auf eine cGAS-Aktivierung hinweist (Abb. 1e). Diese Ergebnisse zeigen, dass Vaccinia E5R einen Hauptinhibitor von cGAS kodiert.

Vaccinia E5 ist ein Polypeptid mit 341 Aminosäuren, das eine N-terminale alpha-helikale Domäne (Aminosäuren 60–106) und zwei BEN-Domänen am C-Terminus (Aminosäure 112–222 und Aminosäure 233–328) umfasst (ergänzende Abb . 2a). BEN wurde nach seinem Vorkommen in BANP/SMAR1, dem Pockenvirus E5R und NAC120 benannt, und BEN-Domänen enthaltende Proteine ​​wirken bei der DNA-Bindung, der Chromatin-Organisation und der Transkriptionsrepression34,35,36. E5R ist bei Orthopoxviren konserviert (ergänzende Abbildung 2b. c), bei Yatapoxviren und Myxomaviren jedoch weniger. Allerdings fehlen E5R-Orthologe in Parapoxviren, Entomopoxviren, Geflügelpocken und Molluscum contagiosum-Viren (Daten nicht gezeigt). Die E5-Proteine ​​von Vaccinia (Western Reserve (WR)-Stamm und Copenhagen-Stamm), Variola (der Erreger von Pocken) und Kuhpockenviren enthalten im Vergleich zu E5-Proteinen von Vaccinia (Ankara) eine zusätzliche Sequenz von 10 Aminosäuren an den N-Termini ), MVA und Ektromelie (Mausepocken) (Ergänzende Abbildung 2c). Interessanterweise weist Monkeypox E5 sowohl am N- als auch am C-Terminus große Deletionen auf (ergänzende Abbildung 2c)37.

Um zu testen, ob Vaccinia E5 ein Virulenzfaktor ist, führten wir ein intranasales Infektionsexperiment mit WT-VACV oder VACV∆E5R (2 × 106 pfu) bei WT-C57BL/6J-Mäusen durch. Alle mit WT-VACV infizierten Mäuse verloren ab dem dritten Tag der Infektion schnell an Gewicht und starben entweder oder wurden aufgrund eines Gewichtsverlusts von mehr als 30 % am Tag 7 bis 8 nach der Infektion eingeschläfert (Abb. 2a, b). Im Gegensatz dazu verloren mit VACV∆E5R infizierte Mäuse am Tag 6 nach der Infektion durchschnittlich fast 15 % ihres ursprünglichen Körpergewichts und erholten sich dann wieder (Abb. 2a, b). Um die Möglichkeit auszuschließen, dass VACV∆E5R eine Abschwächung der Replikation aufweist, haben wir die Plaquegrößen und Replikationskinetik zwischen WT-VACV und VACV∆E5R in BSC40-Zellen verglichen. Wir fanden heraus, dass VACV∆E5R replikationskompetent war und in vitro eine ähnliche Replikationskinetik wie WT VACV aufwies (ergänzende Abbildung 3a, b). Allerdings führte eine intranasale Infektion mit WT-VACV bei 2 × 105 pfu zu viel höheren Titern in den infizierten Lungen, Milz, Leber und Blut am Tag 6 nach der Infektion im Vergleich zu den Geweben, die aus VACV∆E5R (2 × 107 pfu) entnommen wurden. infizierte C57BL/6J-Mäuse am Tag 6 nach der Infektion (ergänzende Abbildung 3c). Diese Ergebnisse zeigen, dass VACV∆E5R zwar in vitro eine ähnliche Replikationskapazität wie WT-VACV aufweist, in vivo jedoch abgeschwächt ist, was wahrscheinlich auf angeborene Immunantworten des Wirts zurückzuführen ist, die durch eine VACV∆E5R-Infektion hervorgerufen werden. Die verringerten Virustiter in verschiedenen Geweben nach einer VACV∆E5R-Infektion korrelieren mit einem geringeren Gewichtsverlust und einem besseren Überleben der infizierten Tiere (Abb. 2a, b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass VACV∆E5R im Vergleich zu WT-VACV abgeschwächt ist und belegen somit, dass E5 ein Virulenzfaktor ist. Darüber hinaus gewann VACV∆E5R (2 × 107 pfu) in cGas-/- oder Stinggt/gt-Mäusen an Virulenz, blieb jedoch in Mda5-/--Mäusen abgeschwächt, was darauf hindeutet, dass der durch cGAS oder STING vermittelte zytosolische DNA-Sensorweg für den Wirt unverzichtbar ist Abwehr einer intranasalen Infektion mit VACV∆E5R (Abb. 2c, d). Darüber hinaus konnten wir 48 Stunden nach der VACV∆E5R-Infektion IFN-β in der bronchoalveolären Lavage (BALF) nachweisen (Abb. 2e), was darauf hindeutet, dass eine intranasale Infektion mit VACV∆E5R-Infektion die IFN-β-Produktion in vivo induzieren könnte.

a, b Prozentsätze des Anfangsgewichts (a) und der Kaplan-Meier-Überlebenskurven (b) von WT-C57BL/6J-Mäusen (n = 5 in jeder Gruppe) über Tage nach der intranasalen Infektion mit entweder WT-VACV oder VACV∆E5R in einer Dosis von 2 × 106 pfu pro Maus. c, d Prozentsätze des Anfangsgewichts (c) und Kaplan-Meier-Überlebenskurven (d) von WT-, Mda5−/−-, cGas−/−- oder Stinggt/gt-Mäusen (n = 5 in jeder Gruppe) über Tage nach der intranasalen Verabreichung Infektion mit VACV∆E5R in einer Dosis von 2 × 107 pfu pro Maus. e ELISA-Analyse der IFN-β-Spiegel im BALF von WT-Mäusen 48 Stunden nach der Infektion mit WT-VACV oder VACV∆E5R in einer Dosis von 2 × 107 pfu pro Maus. n = 5 unabhängige Stichproben. f Schematische Darstellung der VACV E5R-Revertante in voller Länge und verschiedener VACV E5R-Verkürzungsmutanten. g RT-qPCR-Analyse der Ifnb-Spiegel in WT-BMDCs, die mit verschiedenen Vacciniaviren infiziert sind, einschließlich VACV, VACV∆E5R, VACV-E5R-FL-Revertant und verschiedenen VACV-E5R-Verkürzungsmutanten, bei einer MOI von 10 für 6 Stunden. n = 3 unabhängige Stichproben. h, i Prozentsätze des Anfangsgewichts (h) und Kaplan-Meier-Überlebenskurven (i) von WT C57BL/6J-Mäusen (n = 5 in jeder Gruppe) über Tage nach der intranasalen Infektion mit VACV∆E5R, VACV-E5R in voller Länge Revertant und verschiedene E5R-Verkürzungsmutanten eine Dosis von 2 × 107 pfu pro Maus. Für den Vergleich zweier Gruppen in den Studien wurde der zweiseitige, ungepaarte Student-t-Test verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um zu bestimmen, welche Domäne(n) von E5 für die E5-vermittelte Hemmung der IFNB-Induktion und -Virulenz erforderlich sind, haben wir VACV-E5R (volle Länge; FL) und eine Reihe seiner Trunkierungsmutanten konstruiert (Abb. 2f). BMDCs wurden mit WT-VACV, VACV∆E5R, VACV-E5R-FL und den E5R-Verkürzungsmutanten infiziert. Die Expression von Vaccinia C7 wurde durch Western-Blot-Analyse bestimmt, um eine Virusinfektion zu verifizieren (ergänzende Abbildung 3d). Quantitative Echtzeit-PCR wurde verwendet, um die Ifnb1-Genexpression in infizierten BMDCs zu bestimmen. Während VACV-E5R (volle Länge) die Ifnb1-Genexpression in BMDC-Zellen nur geringfügig induzierte (Abb. 2g), induzierten alle E5R-Verkürzungsmutanten die Ifnb1-Genexpression in einem ähnlichen Ausmaß wie VACV∆E5R (Abb. 2g). Darüber hinaus zeigte die intranasale Infektion von VACV-E5R- (voller Länge) und E5R-Verkürzungsmutanten (2 × 107 pfu) bei C57BL/6J-Mäusen, dass nur die VACV-E5R-Infektion (vollständige Länge) tödlich war, während alle Verkürzungsmutanten verursachten Vorübergehender Gewichtsverlust, aber 100 % Überleben, mit Ausnahme von VACV-E5R∆224N (mit 80 % Überleben) (Abb. 2h, i). Diese Ergebnisse zeigten, dass alle E5-Domänen, einschließlich der N-terminalen Alpha-Helix-Domäne und der beiden BEN-Domänen, für die Unterdrückung der Ifnb-Genexpression und -Virulenz erforderlich sind.

Um zu untersuchen, ob das E5R-Gen des MVA-Genoms ein funktionelles Protein kodiert, haben wir MVA∆E5R generiert. Die MVA∆E5R-Infektion von BMDCs steigerte die Genexpression von Ifnb1, Ifna, Ccl4 und Ccl5 stark (Abb. 3a), wohingegen die MVA-Infektion eine mäßige Induktion aufwies. Eine MVA∆E5R-Infektion von BMDCs induzierte viel höhere IFN-β-Sekretion als MVA, hitzeinaktiviertes MVA (Hitze-iMVA) oder hitzeinaktiviertes MVA∆E5R (Hitze-iMVA∆E5R) (Abb. 3b). Die Expression von Vaccinia E3L war zwischen MVA und MVA∆E5R vergleichbar (Abb. 3c). Die E3L-Genexpression wurde nicht wie erwartet in hitzeinaktivierten MVA (Heat-iMVA) oder hitzeinaktivierten MVA∆E5R (Heat-iMVA∆E5R) infizierten BMDCs nachgewiesen. Die IFN-β-Induktion in BMDCs hing von der Virusdosis ab (ergänzende Abbildung 4a). Die IFN-α-Sekretion wurde auch durch eine MVA∆E5R-Infektion in BMDCs stark induziert (Abb. 3d). Darüber hinaus verursachte MVA∆E5R in BMDCs eine viel höhere cGAMP-Produktion als MVA (Abb. 3e), was darauf hindeutet, dass E5 auf cGAS abzielt.

eine RT-qPCR der Ifnb1-, Ifna-, Ccl4- und Ccl5-Genexpression in WT-BMDCs, die entweder mit MVA oder MVA∆E5R infiziert waren, bei einer MOI von 10 für 6 Stunden. n = 3 unabhängige Stichproben. b ELISA-Analysen der IFN-β- oder IFN-α-Spiegel in den Überständen von WT-BMDCs, die mit MVA, MVA∆E5R, Heat-iMVA oder Heat-iMVA∆E5R infiziert waren, bei einer MOI von 10 für 16 Stunden. n = 3 unabhängige Stichproben. c RT-qPCR-Analyse der E3-Genexpression in WT-BMDCs, die mit verschiedenen Vacciniaviren bei einer MOI von 10 für 16 Stunden infiziert waren. n = 3 unabhängige Stichproben. d ELISA-Analysen der IFN-α-Spiegel in den Überständen von WT-BMDCs, die mit MVA oder MVA∆E5R infiziert waren, bei einer MOI von 10 für 16 Stunden. n = 3 unabhängige Stichproben. e ELISA-Analysen der cGAMP-Spiegel in WT-BMDCs, die mit MVA oder MVA∆E5R infiziert waren, bei einer MOI von 10 für 16 Stunden. n = 3 unabhängige Stichproben. f ELISA-Analysen der IFN-β-Spiegel im BMDC von WT-, cGas−/−-, Stinggt/gt-, Irf3−/−- und Irf7−/−-Mäusen, die 16 Stunden lang mit MVA oder MVA∆E5R bei einer MOI von 10 infiziert waren. n = 3 unabhängige Stichproben. ***p < 0,001. Für den Vergleich zweier Gruppen in den Studien wurde der zweiseitige, ungepaarte Student-t-Test verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Ähnlich wie bei BMDC induzierte auch eine MVA∆E5R-Infektion von aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen (BMM) oder primären dermalen Fibroblasten eine viel höhere IFN-β-Sekretion als MVA (ergänzende Abbildung 4b, c). Diese Ergebnisse zeigten, dass Vaccinia E5 die cGAS-Aktivierung blockiert und die Deletion von E5R aus dem MVA-Genom den cGAS/STING-Weg in mehreren myeloischen Zelltypen wirksam aktiviert. Darüber hinaus wurde die MVA∆E5R-induzierte IFN-β-Sekretion von BMDCs in cGAS-/- oder STINGGt/Gt-Zellen aufgehoben und in IRF3-/- oder IRF7-/-Zellen verringert (Abb. 3f). Zusätzlich zu BMDCs war die MVA∆E5R-induzierte IFN-β-Sekretion in BMMs oder primären Fibroblasten auch vom cGAS/STING-Signalweg abhängig (ergänzende Abbildung 4b, c). Diese Ergebnisse zeigen, dass der cGAS/STING-vermittelte zytosolische DNA-Sensorweg und die Transkriptionsfaktoren IRF3 und IRF7 für die MVA∆E5R-induzierte IFN-β-Sekretion in verschiedenen primären Zelltypen erforderlich sind.

Zusätzlich zur viralen Eltern-DNA, die von den ankommenden Virionen bereitgestellt wird, kann auch virale Nachkommen-DNA, die nach der DNA-Replikation in den Virosomen erzeugt wird, den zytosolischen DNA-Sensor cGAS stimulieren, was zur IFN-β-Produktion führt. Um dies zu bewerten, verwendeten wir Phosphonoacetat (PAA) oder Aphidicolin, um die virale DNA-Replikation zu blockieren38,39. Die PAA- oder Aphidicolin-Behandlung von MVA∆E5R-infizierten MEFs blockierte wie erwartet die Virosomenbildung (ergänzende Abbildung 4d) und hob die Expression viraler später Gene wie A27 und A34 auf (ergänzende Abbildung 4e). Sowohl die durch MVA∆E5R induzierte Ifnb1- als auch die Ifna-Genexpression waren in Gegenwart von PAA oder Aphidicolin teilweise reduziert (ergänzende Abbildung 2e). Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass sowohl die virale Eltern- als auch die Nachkommen-DNA von MVA∆E5R-infizierten BMDCs zur Typ-I-IFN-Induktion beitragen.

Um zu untersuchen, wie E5 den cGAS/STING-Signalweg antagonisiert, haben wir zunächst die cGAS-Proteinspiegel nach einer WT-VACV-Infektion untersucht. Wir beobachteten, dass die cGAS-Proteinspiegel sechs Stunden nach der WT-VACV-Infektion in BMDCs im Vergleich zur Scheininfektionskontrolle niedriger waren (Abb. 4a), was darauf hindeutet, dass das cGAS-Protein nach einer Virusinfektion abgebaut werden könnte. Die Behandlung mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 verhinderte den cGAS-Abbau, wohingegen die Behandlung mit einem Pan-Caspase-Inhibitor, Z-VAD oder einem AKT1/2-Inhibitor VIII nur geringe Auswirkungen auf die cGAS-Spiegel hatte (Abb. 4a). Die Behandlung mit dem Proteintranslationshemmer Cycloheximid (CHX) blockierte teilweise den cGAS-Abbau, was darauf hindeutet, dass die neu synthetisierten viralen Proteine ​​den cGAS-Abbau erleichtern könnten (Abb. 4a). Der Vaccinia-C7-Proteinspiegel in infizierten Zellen wurde zur Überprüfung der Infektion und der Arzneimittelwirkungen verwendet. Beispielsweise fehlte das C7-Protein in mit WT-VACV infizierten Zellen in Gegenwart von CHX (Abb. 4a). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der durch WT VACV induzierte cGAS-Abbau proteasomabhängig ist. Im Gegensatz zu WT-VACV führte die VACV∆E5R-Infektion von BMDCs nicht zum cGAS-Abbau (Abb. 4b). Während eine MVA-Infektion von BMDCs den cGAS-Abbau auslöste, war dies bei einer MVA∆E5R-Infektion nicht der Fall (Abb. 4c), was bestätigt, dass E5 im Zusammenhang mit einer VACV- oder MVA-Infektion zum cGAS-Abbau beiträgt.

ein Immunblot von cGAS in MEFs, die mit WT-VACV infiziert waren, bei einer MOI von 10 für 6 Stunden. Die Zellen wurden 30 Minuten lang mit Cycloheximid (CHX, 25 µg/ml), Proteasom-Inhibitor MG132 (25 µM), Pan-Caspase-Inhibitor Z-VAD (50 µM) und AKT1/2-Inhibitor VIII (10 µM) vorbehandelt und dann mit infiziert WT VACV in Gegenwart jedes einzelnen Arzneimittels. Die Zellen wurden 6 Stunden nach der Infektion gesammelt. b, c Immunblot von cGAS in BMDCs, die mit dem angegebenen Virus bei einer MOI von 10 infiziert waren. Die Zellen wurden 30 Minuten lang mit oder ohne MG132 (25 µM) vorbehandelt, bevor sie mit dem Virus infiziert wurden. Die Zellen wurden zum angegebenen Zeitpunkt nach der Infektion gesammelt. d BMDCs wurden mit MVA bei einer MOI von 10 infiziert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Zellen gesammelt und die gesamten ubiquitinierten Proteine ​​wurden durch Halo-4xUBAUBQLN1-Kügelchen heruntergezogen. Ubiquitiniertes cGAS wurde durch den Anti-cGAS-Antikörper nachgewiesen. mUB-cGAS monoubiquitiniertes cGAS, Poly-UB-cGAS polyubiquitiniertes cGAS, PD-Pulldown. Die HEK293T-Zellen wurden mit V5-cGAS- und HA-Ub-exprimierenden Plasmiden (nur WT oder K48) co-transfiziert. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Zellen mit MVA oder MVAΔE5R bei MOI 10 für 6 Stunden in Gegenwart von MG132 (25 µM) infiziert. cGAS wurde durch einen Anti-V5-Antikörper reduziert und ubiquitiniertes cGAS wurde durch einen Anti-HA-Antikörper bestimmt. IP-Immunpräzipitation. WCL-Ganzzelllysate. f Repräsentative konfokale Bilder, die die E5-Flag-Position in BMDCs nach einer MVAΔE5R-E5-Flag- oder MVAΔE5R-E5R95K-Flag-Infektion bei einem MOI 10 für 6 Stunden zeigen. E5-Flag wurde mit einem Anti-Flag-Antikörper angefärbt. Maßstabsbalken, 50 μm. g Immunoblot von E5-Flag in Zytoplasma- und Kernextrakten von BMDCs, die mit MVAΔE5R-E5-Flag oder MVAΔE5R-E5R95K-Flag bei einer MOI von 10 für 6 Stunden infiziert waren. CE-Zytoplasmaextrakt, NE-Kernextrakt. h ELISA-Analysen der IFN-β-Spiegel in Überständen von BMDCs, die mit MVA, MVA∆E5R, MVAΔE5R-E5-Flag oder MVAΔE5R-E5R95K-Flag bei einer MOI von 10 für 16 Stunden infiziert waren. n = 3 unabhängige Stichproben. Für den Vergleich zweier Gruppen in den Studien wurde der zweiseitige, ungepaarte Student-t-Test verwendet. Die Daten sind repräsentativ für zwei (f) oder drei (a–e) unabhängige Experimente und werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um zu testen, ob eine MVA-Infektion von BMDCs die Ubiquitinierung von endogenem cGAS auslöst, wurden BMDCs für die angegebenen Zeiten mit MVA bei einer MOI von 10 in Gegenwart von MG132 infiziert. Die gesamten ubiquitinierten Proteine ​​von MVA-infizierten BMDC wurden durch Halo-4×UBAUBQLN1-Kügelchen angereichert, die vier Tandem-Ubiquitin-assoziierte (UBA) Domänen von Ubiquilin-1 enthalten, um ubiquitinierte Proteine ​​spezifisch abzubauen40. Sowohl monoubiquitinierte als auch polyubiquitinierte cGAS-Banden wurden bereits 2 Stunden nach der Infektion nachgewiesen und nahmen 4 und 6 Stunden nach der Infektion zu (Abb. 4d). Dieses Ubiquitinierungsmuster korrelierte mit der Kinetik des cGAS-Abbaus. Wir haben in allen Proben auch unmodifiziertes cGAS nachgewiesen, was höchstwahrscheinlich auf die unspezifische Bindung von unmodifiziertem cGAS an die Kügelchen und/oder die Bildung von Oligomerkomplexen mit ubiquitiniertem cGAS zurückzuführen ist.

Wir stellten die Hypothese auf, dass Vaccinia E5 die Ubiquitinierung von cGAS und den anschließenden Proteasom-abhängigen Abbau induzieren könnte. Um dies zu testen, wurden HEK293T-Zellen mit V5-cGAS- und HA-Ub-exprimierenden Plasmiden (nur WT oder K48) co-transfiziert. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Zellen dann mit MVA oder MVAΔE5R in Gegenwart von MG132 infiziert. cGAS wurde durch einen Anti-V5-Antikörper reduziert und ubiquitiniertes cGAS wurde durch einen Anti-HA-Antikörper bestimmt. Wir haben in mit MVA infizierten Zellen im Vergleich zu mit MVA∆E5R infizierten Zellen ein höheres Maß an cGAS-Ubiquitinierung, insbesondere K48-verknüpfter Polyubiquitinierung, festgestellt (Abb. 4e). Unsere Ergebnisse legen daher nahe, dass durch MVA exprimiertes E5 die K48-verknüpfte Polyubiquitinierung von cGAS fördert, was zu dessen Abbau führt.

Um die E5-Expression zu visualisieren, haben wir ein rekombinantes Virus MVA∆E5R-E5-Flag generiert. Die konfokale Bildgebung von mit MVA∆E5R-E5-Flag infizierten BMDCs zeigte sowohl die zytoplasmatische als auch die Kernlokalisation von E5 (Abb. 4f). Die Western-Blot-Analyse bestätigte, dass E5 sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern exprimiert wurde (Abb. 4g). GAPDH wurde als Positivkontrolle für zytoplasmatisches Protein und Lamin B1 als Positivkontrolle für Kernprotein verwendet. Darüber hinaus führte die MVA∆E5R-E5-Flag-Infektion von BMDCs zu einer viel geringeren IFN-β-Produktion als MVA∆E5R (Abb. 4h), was darauf hindeutet, dass die Markierung von E5 mit Flag am C-Terminus des Proteins seine Hemmfunktion beibehielt der cGAS/STING-Weg. Im Prozess der Generierung des MVA∆E5R-E5-Flag-Virus mittels Arzneimittelauswahl haben wir einen mutierten Stamm, MVA∆E5R-E5R95K-Flag, isoliert, der eine einzelne Nukleotidveränderung (G284A) enthält, was zum Ersatz von Arginin an der Aminogruppe führt Säure 95 von E5 durch Lysin. E5R95K-Flag wurde im Zytoplasma exprimiert, befand sich jedoch nicht im Kern von MVA∆E5R-E5R95K-Flag-infizierten BMDCs (Abb. 4f). Der Western Blot bestätigte, dass nach einer MVA∆E5R-E5R95K-Flag-Infektion in BMDCs nur das zytoplasmatische, aber nicht das Kern-E5R95K-Flag-Protein nachgewiesen wurde (Abb. 4g). Darüber hinaus war die IFN-β-Produktion in mit MVA∆E5R-E5R95K-Flag infizierten BMDCs verringert (Abb. 4h), was der Produktion von mit MVA∆E5R-E5-FLAG infizierten BMDCs ähnelte, was darauf hindeutet, dass das zytoplasmatische E5 ausreichend ist um die IFN-Produktion vom Typ I zu unterdrücken.

Um zu testen, ob E5 allein den cGAS-Abbau ohne Virusinfektion auslösen kann, haben wir ein cGAS-exprimierendes Plasmid mit einem E5R-exprimierenden Plasmid oder einem leeren Vektor in HEK293T-Zellen co-transfiziert. 24 Stunden später wurden die Zellen 6 Stunden lang mit MVAΔE5R bei einer MOI von 10 infiziert. Wir beobachteten, dass der cGAS-Spiegel nach der Co-Transfektion mit dem E5R-exprimierenden Plasmid, jedoch nicht mit dem leeren Vektor, verringert war (Abb. 5a). Darüber hinaus konnte die MVA∆E5R-Infektion den E5-vermittelten cGAS-Abbau nicht verstärken (Abb. 5a), was darauf hindeutet, dass E5 allein den cGAS-Abbau auslösen kann, wahrscheinlich im Zusammenhang mit der Plasmidtransfektion. Als nächstes testeten wir, ob die Überexpression von E5 durch lentivirale Transduktion in MEFs auch zum cGAS-Abbau führte. MEFs wurden entweder mit einem lentiviralen Vektor, der mcherry oder E5-Flag exprimierte, transduziert. Achtundvierzig Stunden später wurden Zelllysate gesammelt und die cGAS-Expression bestimmt. Wir beobachteten, dass die Überexpression des E5-Flags auch die endogenen cGAS-Spiegel in MEFs senkte (Abb. 5b).

a HEK293T-Zellen wurden mit V5-cGAS- und pcDNA-E5R-Flag- oder pcDNA3.1-Plasmiden co-transfiziert. 24 Stunden später wurden die Zellen 6 Stunden lang mit MVAΔE5R bei einer MOI von 10 infiziert. Die V5-cGAS-Proteinspiegel wurden mit einem Anti-V5-Antikörper bestimmt. Das C7-Protein wurde gemessen, um eine MVAΔE5R-Infektion anzuzeigen. b MEF-Zellen wurden mit Retroviren infiziert, die E5R-Flag oder mcherry exprimierten. Achtundvierzig Stunden später wurden die cGAS-Proteinspiegel mit einem Anti-cGAS-Antikörper bestimmt. c HEK293T-Zellen wurden mit einem V5-cGAS- und pcDNA-E5R-Flag- oder pcDNA3.1-Plasmid transfiziert. Vierundzwanzig Stunden später wurden Zelllysate mit oder ohne Benzonase (250 U/ml) behandelt. V5-cGAS wurde durch einen Anti-V5-Antikörper heruntergezogen und E5-Flag wurde durch einen Anti-Flag-Antikörper bestimmt. d BMDCs von WT- oder cGas-/-Mäusen wurden 6 Stunden lang mit MVAΔE5R-E5R-Flag bei einer MOI von 10 infiziert. Zelllysate wurden mit oder ohne Benzonase (250 U/ml) behandelt. cGAS wurde durch einen Anti-cGAS-Antikörper heruntergezogen und E5-Flag wurde durch einen Anti-Flag-Antikörper bestimmt. e Repräsentative konfokale Bilder, die E5-Flag- und cGAS-Positionen in BMDCs nach MVAΔE5R-E5-Flag-Infektion bei einem MOI 10 für 6 Stunden zeigen. E5-Flag wurde mit einem Anti-Flag-Antikörper angefärbt. Endogenes cGAS wurde durch einen Anti-cGAS-Antikörper gefärbt. Maßstabsbalken, 15 μm. f HEK293T-Zellen wurden mit einem V5-cGAS- und pcDNA-E5R-Flag- oder pcDNA3.1-Plasmid transfiziert. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Zellen gesammelt, nachdem sie 6 Stunden lang mit MG132 (25 µM) behandelt worden waren, und die gesamten ubiquitinierten Proteine ​​wurden durch Halo-4xUBAUBQLN1-Kügelchen heruntergezogen. Ubiquitiniertes cGAS wurde durch den Anti-cGAS-Antikörper nachgewiesen. mUB-cGAS monoubiquitiniertes cGAS, Poly-UB-cGAS polyubiquitiniertes cGAS, PD-Pulldown. g Arbeitsmodell von Vaccinia E5 antagonisiert zytoplasmatisches cGAS. Die Daten sind repräsentativ für zwei (e) oder drei (a–d) unabhängige Experimente und werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um zu beurteilen, ob E5 und cGAS miteinander interagieren, haben wir HEK293T-Zellen mit V5-cGAS- und E5-Flag-Expressionsplasmid transfiziert. Immunpräzipitation mit Anti-V5-Antikörper senkte die E5-Flagge, was auf eine E5-cGAS-Wechselwirkung hinweist (Abb. 5c). Um zu testen, ob DNA für die Vermittlung der E5- und cGAS-Interaktion erforderlich ist, wurden Zelllysate mit oder ohne Benzonase behandelt, einer Endonuklease, die sowohl DNA als auch RNA entfernt. Die Behandlung mit Benzonase konnte die E5-cGAS-Wechselwirkung nicht stören, was darauf hindeutet, dass diese Wechselwirkung nicht durch DNA vermittelt wird (Abb. 5c). Als nächstes testeten wir, ob das durch MVA∆E5R-E5-Flag ausgedrückte E5-Flag mit endogenem cGAS in BMDCs interagierte. Kurz gesagt, WT- und cGAS-/- BMDCs wurden 6 Stunden lang mit MVA∆E5R-E5-Flag bei einer MOI von 10 infiziert. Zelllysate wurden mit oder ohne Benzonase behandelt. cGAS wurde durch einen Anti-cGAS-Antikörper heruntergezogen und E5-Flag wurde durch einen Anti-Flag-Antikörper bestimmt. Der Co-Immunpräzipitationstest zeigte, dass cGAS in WT-BMDCs mit E5-Flag interagierte und die Benzonase-Behandlung die Interaktion nicht unterbrechen konnte (Abb. 5d). Wir konnten eine solche Interaktion in cGAS-/- BMDCs nicht feststellen. Wir haben auch die Co-Lokalisierung von E5-Flag und endogenem cGAS in BMDCs visualisiert, die mit MVA∆E5R-E5-Flag infiziert waren (Abb. 5e). Darüber hinaus förderten die Kotransfektions-cGAS- und E5R-exprimierenden Plasmide in HEK293T-Zellen eine stärkere cGAS-Ubiquitinierung als cGAS allein (Abb. 5f). Gemeinsam konnten wir mithilfe von Plasmidtransfektion, lentiviraler Transduktion und MVA∆E5R-E5-Flag-Infektionsansätzen in mehreren Säugetierzelltypen, darunter HEK293T, MEFs und BMDCs, Wechselwirkungen zwischen E5 und cGAS nachweisen, die unabhängig von der DNA-Bindung sind. Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass E5 die Ubiquitinierung von cGAS und den anschließenden Abbau über einen Proteasom-abhängigen Mechanismus verstärkt (Abb. 5g).

MVA wurde als Impfstoffvektor für verschiedene Infektionskrankheiten10 wie HIV, Tuberkulose, Malaria, Ebola und SARS-CoV-2 untersucht, und eine MVA-Infektion aktiviert in geringem Maße humane Monozyten-abgeleitete DCs (moDCs)41. Um zu untersuchen, ob die E5R-Deletion die Immunogenität des viralen Vektors verbessert, haben wir zunächst MVA∆E5R-OVA generiert, das ein Modellantigen Hühnerovalbumin (OVA) exprimiert, und dann die DC-Reifung bei MVA∆E5R-OVA mit der MVA-OVA-Infektion verglichen. Wir beobachteten, dass eine MVA∆E5R-OVA-Infektion 24 Stunden nach der Infektion im Vergleich zu MVA-OVA höhere Werte der CD86- und CD40-Expression induzierte (Abb. 6a – c). Allerdings verringerte sich sowohl die MVA∆E5R-OVA- als auch die MVA-OVA-induzierte CD86- und CD40-Expression in cGAS-/− BMDCs, was darauf hindeutet, dass der zytosolische DNA-Sensorweg für die MVA∆E5R-OVA- oder MVA-OVA-induzierte DC-Reifung essentiell ist (Abb. 6a–c).

a–c Repräsentative Durchflusszytometrie-Punktdiagramme (a, b) oder Analyse (c) der CD86- und CD40-Expression in WT oder cGas−/− BMDC, infiziert mit MVA-OVA oder MVAΔE5R-OVA bei MOI 10 für 16 Stunden. n = 3 unabhängige Stichproben. d Heatmap, die die relative Expression ausgewählter immunbezogener Gene bei WT- oder cGas−/− BMDC-Infektion mit MVA oder MVA∆E5R zeigt. Dazu gehören Gene, die an der Antigenpräsentation, der DC-Aktivierung, IFN und proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen sowie angeborenen Immunsensoren beteiligt sind. e Antigenspezifische T-Zell-Antworten nach Impfung mit MVA-OVA oder MVA∆E5R-OVA. C57BL/6J-Mäuse wurden mit MVA-OVA oder MVAΔE5R-OVA durch Hautskarifizierung (SS) oder intradermale Injektion (ID) geimpft. Eine Woche später wurden Milzen und dränierende Lymphknoten (dLNs) entnommen und SIINFEKL-spezifische CD8+-T-Zellen in Splenozyten und OVA-Tetramer-spezifische CD8+- oder Th1-CD4+-T-Zellen in Lymphknoten durch FACS bestimmt. n = 5 unabhängige Stichproben. Für den Vergleich zweier Gruppen in den Studien wurde der zweiseitige, ungepaarte Student-t-Test verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die RNA-Seq-Analyse von WT- oder cGAS-/−-BMDCs, die entweder mit MVA oder MVA∆E5R infiziert oder scheininfiziert waren, zeigte, dass eine MVA∆E5R-Infektion in WT-BMDCs höhere Spiegel an Typ-I-IFN und proinflammatorischen Zytokin- und Chemokin-Genen induzierte, einschließlich Ifnb1, Ccl5, Ccl12, Il12b, Il6, Il27, DC-Reifungs- und Aktivierungsmarker wie CD86, CD40 und CD69 sowie Gene, die an der Antigen-Kreuzpräsentation beteiligt sind, einschließlich Tap1, H2-Q4, H2-Q6 und H2 -Q7 im Vergleich zu MVA (Abb. 6d und ergänzende Abb. 5a, b). Die Hochregulierung dieser Gene durch MVA und MVA∆E5R war cGAS-abhängig (Abb. 6d und ergänzende Abb. 5a, c).

Als nächstes führten wir eine Impfung durch SS oder intradermale (ID) Injektion mit entweder MVA-OVA oder MVA∆E5R-OVA durch. Eine Woche nach der Impfung wurden Anti-OVA-CD8+- und Th1-CD4+-T-Zellen in der Milz und den dränierenden Lymphknoten analysiert. Die Impfung mit MVA∆E5R-OVA führte zu mehr OVA-spezifischen CD8+-T-Zellen in der Milz als mit MVA-OVA (Abb. 6e). Und in den drainierenden Lymphknoten (dLN) wurden nach der MVA∆E5R-OVA-Impfung im Vergleich zur MVA-OVA mehr OVA-spezifische CD8+- oder Th1-CD4+-T-Zellen nachgewiesen (Abb. 6e). Diese Ergebnisse liefern Hinweise darauf, dass die Deletion des E5R-Gens aus MVA die Antigen-spezifischen T-Zell-Reaktionen nach Impfungen erhöht.

Die Identifizierung von Vaccinia E5 als Hauptinhibitor des zytosolischen DNA-Sensors cGAS unterstreicht die Bedeutung dieses Signalwegs für die Abwehr des Wirts gegen Pockenvirusinfektionen. E5, ein Gründungsmitglied der BEN-Domänenfamilie, ist unter Orthopoxviren konserviert. Hier zeigen wir, dass der Virulenzfaktor E5 an cGAS bindet, die Ubiquitinierung und den Proteasom-abhängigen Abbau von cGAS auslöst und dass die Löschung von E5R aus dem MVA-Virusvektor seine Immunogenität verbessert.

Virulente Pockenviren, darunter VACV (WR- und Copenhagen-Stämme), Kuhpocken- und Ektromelieviren, können STING im Gegensatz zum stark abgeschwächten Derivat MVA nicht aktivieren42,43. Darüber hinaus induziert eine MVA-, aber nicht eine WT-VACV-Infektion von BMDCs die cGAMP-Produktion, was darauf hindeutet, dass VACV einen oder mehrere Inhibitoren von cGAS kodiert. Durch ein unvoreingenommenes Screening von 80 Vaccinia-Genen haben wir mehrere Kandidatengene identifiziert, die für cGAS-Inhibitoren kodieren könnten, darunter E5R, K7R, C11R, WR199/B18R und WR200/B19R. Wir haben uns dann auf E5R konzentriert, da ein VACV-Mutant, dem E5R fehlt, eine mäßige Menge an IFN-β-Sekretion und cGAMP-Produktion in BMDCs induzierte, während VACV-Mutanten, denen andere einzelne Kandidatengene fehlen (einschließlich B2R, E3L, C11R, WR199, WR200, K7R und C7L). ) konnte die IFN-β-Sekretion in BMDCs nicht induzieren. Unter unseren Bedingungen kann VACV, dem das B2R-Gen fehlt, das eine cGAMP-Nuklease kodiert, die IFN-Produktion vom Typ I in BMDC nicht induzieren, was darauf hindeutet, dass es möglicherweise ein oder mehrere zusätzliche Vaccinia-Virusproteine ​​gibt, die den cGAS/STING-Signalweg antagonisieren.

Im Gegensatz zum Wildtyp-VACV induziert die MVA-Infektion von aus dem Knochenmark stammenden dendritischen Zellen Typ-I-IFN auf cGAS/STING-abhängige Weise43. Unsere Studie zeigte, dass E5 in MVA immer noch funktionsfähig ist, da die Entfernung des E5R-Gens aus MVA die Typ-I-IFN-Induktion in BMDCs, BMMs und primären Fibroblasten dramatisch steigert. Andererseits kann das Vorhandensein von E5 in MVA die IFN-Produktion nicht vollständig blockieren, was auf das Fehlen von funktionellem WR200/B19R (IFNAR), B2R oder anderen potenziellen Inhibitoren zurückzuführen sein könnte15. Frühere Studien haben gezeigt, dass mehrere Proteine ​​des Vaccinia-Virus auf die DNA-gesteuerte Typ-I-IFN-Induktion abzielen, wie z. B. B2, C4, C16, F17, N2 und C619,44,45,46,47,48,49. Insbesondere zielen C4 und C16 auf einen anderen DNA-Sensor, DNA-PK, ab, der eine Rolle bei der IRF3-Aktivierung in Fibroblasten44,45,50 spielt, und beide sind in MVA15 mutiert oder verloren.

Obwohl E5 erstmals durch Massenspektrometrie als eines der drei wichtigsten frühen Virusproteine ​​identifiziert wurde, die mit Virosomen in Vaccinia-infizierten Zellen assoziiert sind33, blieb die Funktion von E5 unklar. E5 wurde auch in den hochgereinigten Virionen nach chemischer Vernetzung mittels Massenspektrometrie gefunden und mehrere Interaktionspartner identifiziert, darunter die RNA-Polymerase-Untereinheiten RAP94, RP147 und NTP151. Hier zeigen wir die Präsenz von E5 sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma der infizierten Zellen. In MVA∆E5R-E5R95K-Flag-infizierten Zellen lokalisiert sich E5R95K nur im Zytoplasma, reicht jedoch aus, um die IFN-Hemmung zu vermitteln. Die R95K-Mutation liegt innerhalb eines mutmaßlichen Kernlokalisierungssignals von E5, 92KFKRMIR98.

Wir zeigen, dass E5 den cGAS-Abbau über einen Proteasom-abhängigen Weg vermittelt. Basierend auf unseren Ergebnissen schlagen wir das folgende Arbeitsmodell vor (Abb. 5g). Das Vaccinia-Virus dringt über Makropinozytose in die Wirtszellen ein52. Beim Viruseintritt wird virale DNA vom zytosolischen DNA-Sensor cGAS erkannt, dessen Aktivierung zur cGAMP-Produktion und anschließenden STING-Stimulation führt. In Gegenwart von Vaccinia E5, das hauptsächlich von den ankommenden Virionen als frühes virales Protein synthetisiert wird, wird cGAS jedoch durch die Interaktion mit E5 für die Ubiquitinierung und den proteasomabhängigen Abbau angestrebt. Dies führt zu einer verringerten cGAMP-Produktion und der Ifnb1-Genexpression. Es ist möglich, dass E5 von Wirtsproteinen wie ISGs angegriffen werden könnte. Wir konnten keine direkte Wechselwirkung zwischen cGAS und E5 nachweisen, da trotz vieler Versuche in verschiedenen Proteinexpressionssystemen, darunter bakterielle Expressionssysteme mit Escherichia coli, Insektenzell-Expressionssysteme mit Sf9 und Säugetierzellen-Expression, kein rekombinantes E5-Protein erzeugt werden konnte Systeme, die Eierstöcke des Chinesischen Hamsters verwenden. Obwohl wir in mehreren experimentellen Systemen eine E5- und cGAS-Interaktion über Co-Immunpräzipitation nachweisen konnten, die durch die Benzonase-Behandlung nicht gestört wurde, können wir in dieser Studie nicht den Schluss ziehen, dass cGAS und E5 eine direkte Interaktion haben. Darüber hinaus beobachteten wir, dass einige der neu exprimierten E5 in den Zellkern verlagert werden. Es wurde berichtet, dass nukleares cGAS durch Nukleosomen gehemmt wird53,54. Die genauen Funktionen von nuklearem E5 müssen weiter untersucht werden.

Wir haben zuvor berichtet, dass die Virusreplikation für die MVA-Erkennung in BMDCs nicht wichtig ist. In dieser Studie war jedoch die MVA∆E5R-induzierte Ifnb1-Genexpression in Gegenwart der viralen DNA-Replikationsinhibitoren PAA und Aphidicolin teilweise reduziert. Dieses Ergebnis legt nahe, dass virosomale Nachkommen-DNA im Rahmen einer MVA∆E5R-Infektion durch cGAS nachgewiesen wird. Wir vermuten, dass in Gegenwart von E5 während einer MVA-Infektion die virosomale Nachkommen-DNA vor der cGAS-Erkennung geschützt sein könnte.

Es wurde über verschiedene posttranslationale Modifikationen von cGAS berichtet, darunter Ubiquitinierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Sumoylierung, ISGylierung, Glutamylierung, Neddylierung und Caspase-vermittelte Spaltung55,56. Beispielsweise wurde gezeigt, dass RNF185, eine Ubiquitin-Ligase der RING-Domäne E3, während einer Infektion mit dem humanen Simplex-Virus-1 (HSV-1) mit cGAS interagiert und die K27-verknüpfte Polyubiquitinierung von cGAS stimuliert, was für die enzymatische Aktivität von cGAS wichtig ist57. TRIM56, eine IFN-induzierbare E3-Ubiquitin-Ligase, interagiert mit cGAS, um die Monoubiquitinierung und die cGAMP-Produktion zu fördern58. Darüber hinaus rekrutiert TRIM14, ein IFN-induzierbares Protein, USP14, um K48-verknüpfte Poly-Ubiquitin-Ketten von cGAS zu spalten und dadurch den cGAS-Abbau über Autophagie zu hemmen59. Die Ubiquitin-E3-Ligase, die für die K48-verknüpfte Poly-Ubiquitinierung von cGAS verantwortlich ist, ist weiterhin unbekannt59. Hier zeigen wir, dass eine MVA-Infektion die Mono- und Polyubiquitinierung von cGAS induziert und dessen Abbau proteasomabhängig fördert. E5 ist für diesen Prozess durch die Interaktion mit cGAS von entscheidender Bedeutung. Die genauen Einzelheiten darüber, wie E5 eine virale oder zelluläre E3-Ubiquitin-Ligase rekrutiert, um die Ubiquitinierung von cGAS zu katalysieren, müssen jedoch noch ermittelt werden.

Die Entdeckung von E5 als Hauptinhibitor von cGAS liefert wichtige Erkenntnisse zur Verbesserung von MVA als Impfstoffvektor. Hier zeigen wir, dass eine MVA∆E5R-OVA-Infektion von BMDCs ein hohes Maß an IFN-β-Produktion und DC-Reifung induziert, was mit cGAS-abhängigen transkriptomischen Veränderungen vereinbar ist, die durch MVA∆E5R hervorgerufen werden. Die Impfung mit MVA∆E5R-OVA induziert im Vergleich zu MVA-OVA höhere Mengen an OVA-spezifischen CD8+- und Th1-CD4+-T-Zellen. Jüngste Studien haben gezeigt, dass MVA-basierte Impfstoffvektoren, die das SARS-CoV-2-Spike-Protein exprimieren, starke Anti-Spike-T- und B-Zell-Immunantworten auslösen und Mäusen, Hamstern und Makaken Schutz vor SARS-CoV-2-Infektionen und Lungenimmunpathologie bieten60, 61,62,63,64. Zukünftige Untersuchungen, ob MVA∆E5R-basierte Impfstoffvektoren die Wirksamkeit des Impfstoffs gegen Infektionserreger wie SARS-CoV-2 verbessern, sind gerechtfertigt.

Von allen in dieser Studie identifizierten Vaccinia-kodierten cGAS-Inhibitorkandidaten E5, K7, C11, WR199/B18 und WR200/B19 sowie dem zuvor berichteten B2 (Pocken) induzierte nur die VACV∆E5R-Infektion von BMDCs signifikante Typkonzentrationen I IFN (Abb. 1d). Angesichts der Tatsache, dass die Aktivierung des cGAS/STING-Signalwegs in DCs für die virusinduzierte onkolytische Virustherapie von entscheidender Bedeutung ist65, würde die Entfernung von E5R und möglicherweise anderer Inhibitoren dieses Signalwegs aus der onkolytischen Vaccinia ihre Sicherheit und ihr therapeutisches Potenzial verbessern.

Unsere Forschung entspricht allen relevanten ethischen Vorschriften. Wir haben alle Verfahren in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des National Institute of Health durchgeführt und das Protokoll (Nr. 19-01-002) wurde vom Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) genehmigt ) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle Mäuse wurden in der MSKCC-spezifischen pathogenfreien Tierhaltung unter folgenden Bedingungen gehalten: Temperaturen von 21,1–22,2 °C (70–72 °F), 30–70 % Luftfeuchtigkeit und ein 12:12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus (Licht war von 6 bis 18 Uhr an). Am Ende des Experiments wurden die Mäuse durch CO2-Erstickung eingeschläfert, wobei die Zervixluxation als physikalische sekundäre Sicherungsmethode diente.

C57BL/6J-Mäuse im Alter zwischen 6 und 8 Wochen wurden vom Jackson Laboratory gekauft und zur Herstellung von aus dem Knochenmark stammenden dendritischen Zellen (BMDCs) und für intranasale Infektionsexperimente verwendet. cGas-/-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory gekauft. Stinggt/gt-Mäuse wurden im Labor von Russell Vance (University of California, Berkeley)66 erzeugt. Mda5−/− Mäuse wurden im Labor von Marco Colonna (Washington University) erzeugt67. Irf3-/-Mäuse wurden von Ruslan Medzhitov (Yale University) bereitgestellt. Irf7-/-Mäuse wurden von Shizuo Akira (Universität Osaka) erzeugt. Alle transgenen Mäuse haben einen C57BJ/6J-Hintergrund.

Der WR-Stamm des Vacciniavirus (VACV) (ATCC VR-1354) wurde vermehrt und die Virustiter wurden auf BSC40-Monoschichten (Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze) bei 37 °C bestimmt. MVA wurde freundlicherweise von Gerd Sutter (Universität München) zur Verfügung gestellt und in BHK-21-Zellen (Babyhamster-Nierenzelle, ATCC CCL-10) vermehrt. MVA-OVA war ein freundliches Geschenk von Dr. Ingo Drexler (Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf). Der VACV∆E3L wurde freundlicherweise von BL Jacobs (Arizona State University) zur Verfügung gestellt. Das VACV∆C11R-Virus wurde freundlicherweise von Bernard Moss (National Institutes of Health) zur Verfügung gestellt68. Alle Viren wurden durch ein 36 %iges Saccharosekissen gereinigt. Heat-iMVA oder Heat-iMVA∆E5R wurde durch einstündige Inkubation des gereinigten MVA- oder MVA∆E5R-Virus bei 55 °C erzeugt. Um rekombinantes VACV∆E5R-Virus zu erzeugen, wurden BSC40-Zellen mit WT-Vaccinia-Virus (WR) bei einer MOI von 0,2 infiziert. Nach 1–2 Stunden wurden die Zellen mit pE5R-mCherry-Plasmiden mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen) transfiziert. Die homologe Rekombination zwischen der Plasmid-DNA und dem Vaccinia-Virusgenom führte zur Deletion des E5R-Gens aus dem Virusgenom und zur Insertion von mCherry unter der Kontrolle des synthetischen frühen und späten Vaccinia-Promotors (pSE/L). Die Zellen wurden zwei Tage später gesammelt und drei Einfrier-Auftau-Zyklen unterzogen. Die Plaquereinigung wurde basierend auf der unter dem Mikroskop beobachteten mCherry-Fluoreszenz durchgeführt. Nach 4–5 Runden wurden reine rekombinante VACV∆E5R-mCherry-Viren erhalten und die Validierung der E5R-Deletion wurde durch PCR-Analysen und DNA-Sequenzierung bestätigt. Verschiedene andere Deletionsmutanten, darunter VACV∆WR199, VACV∆K7R, VACV∆C7L, die mcherry exprimieren, VACV∆B2R und VACV∆WR200, die GFP exprimieren, wurden nach einem ähnlichen Verfahren wie oben beschrieben erzeugt. VACV-E5R-FL, VACV-E5R∆59N, VACV-E5R∆106N, VACV-E5R∆224N, VACV-E5R∆117C und VACV-E5R∆235C wurden durch Einfügen von E5R in voller Länge oder verkürztem E5R in den E5R-Locus erzeugt von VACV∆E5R. MVA∆E5R und MVA∆E5R-OVA, die mCherry exprimieren, wurden durch homologe Rekombination an den E4L- und E6R-Loci, die das E5R-Gen des MVA- oder MVA-OVA-Genoms in BHK21-Zellen flankieren, nach einem ähnlichen Verfahren wie oben beschrieben erzeugt. MVA∆E5R–E5-Flag wurde durch Einfügen der E5R-Flag-Sequenz in den TK-Locus von MVA∆E5R erzeugt. Das MVA∆E5R-E5R95K-Flag wurde durch Einfügen der E5R-Flag-Sequenz in den TK-Locus von MVA∆E5R mithilfe der Arzneimittelauswahl erzeugt. Das rekombinante Virus wurde in Gegenwart von gpt-Selektionsmedium, einschließlich MPA, Xanthin und Hypoxanthin, angereichert und Plaque wurde für mindestens vier Runden gereinigt. Während des Selektionsprozesses kam es zu einer spontanen Mutation, die zur Bildung von MVA∆E5R-E5R95K-Flag führte, was durch PCR und DNA-Sequenzierung verifiziert wurde. Die rekombinanten Vacciniaviren wurden durch PCR genomischer viraler DNA verifiziert (ergänzende Abbildung 7).

Weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter zwischen 6 und 8 Wochen (5–10 in jeder Gruppe) wurden anästhesiert und intranasal mit WT VACV, VACV∆E5R oder VACV∆E5 infiziert, die E5R-Revertante in voller Länge und verschiedene E5R-Verkürzungsmutanten zu den angegebenen Zeitpunkten exprimierten Dosen in 20 µl PBS. Die Mäuse wurden täglich überwacht und gewogen. Diejenigen, die mehr als 30 % ihres ursprünglichen Gewichts verloren hatten, wurden eingeschläfert. Es wurden Kaplan-Meier-Überlebenskurven ermittelt. Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) wurde nach intratrachealer Infusion von 1 ml kaltem PBS entnommen. Um Virustiter in verschiedenen Organen zu messen, wurden Lungen, Lebern und Milzen entnommen, in Röhrchen mit 1 ml PBS gegeben und mit dem Miltenyi GentleMACS Dissoziator homogenisiert. Die Zellsuspensionen wurden dreimal einem Einfrier-Auftau-Zyklus unterzogen und vor der Titration auf BSC40-Zellen einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Das Blut wurde in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen gesammelt und das Serum nach der Zentrifugation aufbewahrt. Die Virustiter wurden durch Berechnung der Anzahl der Plaques (pfu) pro Gramm Gewebe (pfu/g) bestimmt.

BSC40 wurde mit WT VACV oder VACV∆E5R bei einer MOI von 0,05 infiziert. Die Zellen wurden dann in das Medium gekratzt und zu den angegebenen Zeiten gesammelt. Nach drei Einfrier-Auftau-Zyklen und anschließender Ultraschallbehandlung wurden die Virustiter in den gesammelten Proben durch Plaque-Assay an BSC40-Zellen bestimmt.

6 bis 8 Wochen alte weibliche C57BL/6J-Mäuse wurden über SS- oder ID-Injektion mit MVA-OVA oder MVA∆E5R-OVA in einer Dosis von 2 × 107 pfu geimpft. Eine Woche später wurden Milzen und Drainagelymphknoten (dLNs) gesammelt und mit dem Miltenyi GentleMACS™ Dissoziator verarbeitet. Splenozyten wurden mit dem Peptid OVA257–264 (SIINFEKL) (5 μg/ml) stimuliert. Nach einer Stunde Stimulation wurde GolgiPlug (BD Biosciences) (Verdünnung 1:1000) hinzugefügt und 12 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit dem BD Cytofix/Cytoperm™-Kit behandelt, bevor sie mit entsprechenden Antikörpern für Durchflusszytometrieanalysen gefärbt wurden. Die für diesen Test verwendeten Antikörper sind wie folgt: BioLegend: CD3e (145-2C11), CD4 (GK1.5), CD8 (53-5.8), IFN-γ (XMG1.2).

dLNs wurden mit Kollagenase D (2,5 mg/ml) und DNase (50 µg/ml) bei 37 °C 25 Minuten lang verdaut, bevor sie durch ein 70-µm-Zellsieb filtriert wurden. Zur Tetramerfärbung wurden die Zellen 30 Minuten lang bei 37 ° C mit Tetrameren inkubiert. Alexa Fluor 647 H-2K(b) ova 257-264 SIINFEKL-Tetramer und PE IA(b) Ova 329-337 AAHAEINEA-Tetramer wurden von der NIH Tetramer Core Facility synthetisiert. Die Zellen wurden auf dem BD LSRFortessa analysiert.

BSC40, HEK293T und MEFs wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (Corning, Kat.-Nr. 10-014-CV) kultiviert, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin und 100 μg /ml Streptomycin. BHK-21 wurde in Eagle's Minimal Essential Medium (Eagle's MEM, Life Technologies, Kat.-Nr. 11095-080) mit 10 % FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin kultiviert. Zur Erzeugung von GM-CSF-BMDCs wurden Knochenmarkszellen (5 Millionen Zellen in jeder 15-cm-Zellkulturschale) in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % FBS, in Gegenwart von GM-CSF (20 ng/ml, BioLegend, Kat.-Nr. 576304) für 9–12 Tage wie zuvor beschrieben43. Zur Erzeugung von aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs) wurden Knochenmarkszellen in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % FBS, in Gegenwart von M-CSF (10 ng/ml, PeproTech, Kat.-Nr. 315-02) kultiviert 7–9 Tage.

Erzeugung von dermalen Hautfibroblasten: Epidermisschichten von Mäusen wurden wie zuvor beschrieben entfernt69. Kurz gesagt, die Häute wurden mit kaltem Ca2+- und Mg2+-freiem PBS gewaschen und dann in einem Verdauungspuffer, der 1 U Dispase/ml enthielt, 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Epidermisschichten wurden mechanisch entfernt und die verbleibende Dermis wurde fünfmal in Ca2+- und Mg2+-freiem PBS gewaschen und in einem Verdauungspuffer mit 2 mg/ml Kollagenase A (Roche), 100 µg/ml DNase I (Sigma, d4527) inkubiert 1 % BSA in Ca2+- und Mg2+-freiem PBS bei 37 °C für 1–2 Stunden. Die resultierende Suspension wurde nacheinander durch ein 100-, 70- und 40-mm-Nylonnetz filtriert (VWR) und zweimal mit einem Puffer (Ca2+- und Mg2+-freies PBS, enthaltend 1 % BSA und 2 mM EDTA) gewaschen. Die Zellen wurden in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % FBS, kultiviert. Nach 2–3 Tagen Kultur wurden nur die adhärenten Zellen verwendet.

Die IFN-β-Spiegel in BALF wurden mit einem Maus-IFN-beta-ProQuantum-Immunoassay-Kit (ThermoFisher) bestimmt. Die IFN-α- und IFN-β-Spiegel in den Überständen kultivierter BMDCs wurden durch ELISA (PBL Biomedical Laboratories) bestimmt.

GM-CSF-BMDCs von WT- oder cGAS-/-Mäusen wurden 16 Stunden lang entweder mit MVA-OVA oder MVA∆E5R-OVA bei einer MOI von 10 infiziert. Die Zellen wurden mit MACS-Puffer (Miltenyi Biotec) gewaschen und mit Antikörpern gegen CD40 (3/23, Biolegend) und CD86 (GL-1, Biolegend) gefärbt. FACS-Analysen wurden mit dem LSRFortessaTM Cell Analyzer (BD Biosciences) durchgeführt. Die Daten wurden mit FACSDiva 8.0 gesammelt und mit der FlowJo-Software (Version 10.5.3) analysiert.

Kultivierte Zellen wurden in Lab-TekTM II-Kammerobjektträgern (ThermoFisher) ausplattiert und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) in 4 % (Gew./Vol.) Paraformaldehyd fixiert und mit 0,5 % (V/V) Triton X-100 in PBS permeabilisiert für 5 Minuten und blockiert in 5 % Ziegenserum (Sigma), 3 % Rinderserumalbumin (Fisher) und 0,1 % Triton X-100 bei RT für 1 Stunde. Primärantikörper wurden über Nacht bei 4 °C in den angegebenen Verdünnungen inkubiert: Maus-Anti-Flag (1:1000, Sigma) und Anti-cGAS (1:1000, Abcam). Nach drei Wäschen in PBS wurden die Objektträger mit den angegebenen sekundären Antikörpern, einschließlich Ziegen-Anti-Maus-Alexa Fluor-647 (1:1000, Invitrogen) und Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa Fluor-488 (1:1000, Invitrogen), 60 Minuten lang bei RT inkubiert Mindest. Nach drei Wäschen in PBS wurden die Objektträger in ProLong Gold Antifade Mountant (ThermoFisher) montiert. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop (Leica TCS SP8 oder Zeiss LSM880) aufgenommen.

Für die Zeitraffer-Bildgebung von Virisomen in MEFs wurden Zellen auf einen Lab-TekTM II-Kammerobjektträger (ThermoFisher) ausgesät, mit MVA∆E5R bei MOI 10 infiziert und mit fluorogener SiR-DNA (Zytoskelett) gefärbt. Die Zellen wurden bei 37 °C, ergänzt mit 5 % CO2, inkubiert. Die Bilder wurden mit einem ZEISS Axio Observer Z1 aufgenommen. Alle Bilder wurden mit der Image J-Software weiterverarbeitet.

Das IFN-β-Reporterplasmid (pIFN-β-luc)70 wurde von Michaela Gack (University of Chicago) bereitgestellt. pRL-TK wurde von Promega gekauft. Das humane STING-Expressionsplasmid wurde von Tom Maniatis (University of Columbia) bereitgestellt. Maus-STING-Sequenzen (mSTING) wurden durch PCR amplifiziert und in pcDNA3.2-DEST-Plasmide kloniert. Humane cGAS- (hcGAS) und murine cGAS-Plasmide (mcGAS) wurden von Invivogen erworben. V5-cGAS wurden durch PCR amplifiziert und in pcDNA3.2-DEST-Plasmide kloniert. pRK-HA-Ubiquitin-WT, pRK-HA-Ubiquitin-K48 und pBabe 12S E1A wurden von Addgene erworben. Achtzig ausgewählte VACV-Gene wurden durch PCR aus dem VACV-WR-Genom amplifiziert und unter Verwendung der Gateway-Klonierungsmethode (Invitrogen) in pcDNA3.2-DEST subkloniert. Mit Flag markierte E1A- und Flag-markierte VACV-Gene wurden durch PCR amplifiziert und unter Verwendung der Gateway-Klonierungsmethode (Invitrogen) in pcDNA3.2-DEST subkloniert. VACV E5R (aa: 55–341) wurde durch PCR aus dem VACV WR-Genom amplifiziert und in pcDNA3.1 und pQCXIP subkloniert.

HEK293T-Zellen wurden in eine Platte mit 6 Vertiefungen geleitet. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit drei Plasmiden – VSVG, gag/pol und pQCXIP-E5R oder pQCXIP mit Lipofectamin 2000 – transfiziert. Nach 2 Tagen wurden die Zellüberstände gesammelt und durch einen 0,45 μm-Filter filtriert und bei –80 °C gelagert.

Die Glühwürmchen- und Renilla-Luciferase-Aktivitäten wurden mit dem Dual-Luciferase Reporter Assay-System gemäß den Anweisungen des Herstellers (Promega) gemessen. Um nach Vaccinia-Inhibitoren des cGAS/STING-Signalwegs zu suchen, wurden cGAS- (50 ng) und STING- (10 ng) Expressionsplasmide zusammen mit pIFN-β-luc (50 ng), pRL-TK (10 ng) ausgewählt Vaccinia-Genexpressionsplasmid oder Adenovirus-E1A-Expressionsplasmid (200 ng) wurden in HEK293T-Zellen transfiziert. Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen gesammelt und lysiert. Um die Wirkung von Vaccinia-Inhibitoren des STING-Signalwegs zu bewerten, wurden das STING-Expressionsplasmid (50 ng) zusammen mit pIFN-β-luc (50 ng), pRL-TK (10 ng) sowie ausgewählte Vaccinia-Genexpressionskonstrukte bzw Adenovirus E1A-Expressionsplasmid (200 ng) wurden in HEK293T-Zellen transfiziert. Die relative Luciferase-Aktivität wurde in willkürlichen Einheiten ausgedrückt, indem die Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität unter dem IFNB-Promotor auf die Renilla-Luciferase-Aktivität aus einem Kontrollplasmid, pRL-TK, normalisiert wurde.

Die Zellen wurden in RIPA-Lysepuffer, ergänzt mit 1× Halt™ Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (ThermoFisher), lysiert. Um zytoplasmatische und nukleare Proteine ​​zu extrahieren, wurden die Zellen mit dem NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Kit (ThermoFisher, 78833) verarbeitet. Proteinproben wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und dann auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und mit primären Antikörpern inkubiert, die für cGAS (CST, 31659), STING (CST, 13647), FLAG (Sigma, F3165), HA (Sigma, H3663), V5 spezifisch sind (ThermoFisher, R960-25), mCherry (ThermoFisher, M11217), β-Actin (Sigma, A2228), Lamin B1 (Sigma, ZRB1143) und GAPDH (CST, 2118) wurden verwendet. Der C7-Antikörper wurde in unserem Labor hergestellt und bereits beschrieben24. Der E3-Antikörper wurde freundlicherweise von Dr. Stuart N. Isaacs (University of Pennsylvania) zur Verfügung gestellt71. Als Sekundärantikörper wurden HRP-konjugierte Anti-Kaninchen-, Maus- oder Ratten-IgG-Antikörper verwendet (CST, 7074, 7076 oder 7077). Der Nachweis wurde mit SuperSignalTM-Substraten (Thermo Fisher, 34577 oder 34095) durchgeführt.

Um ubiquitiniertes cGAS-Protein während einer Vacciniavirus-Infektion nachzuweisen, wurden BMDCs 6 Stunden lang mit MVA bei MOI 10 in Gegenwart von MG132 (25 μg/ml) infiziert. Ubiquitinierte Proteine ​​wurden mit Halo-4× UBAUBQLN1 wie zuvor beschrieben40 gereinigt. Kurz gesagt, Ganzzellextrakte (1 mg) wurden in Lysepuffer mit 100 mM Chloracetamid lysiert und 16 Stunden lang bei 4 °C mit 30 μl Halo-4× UBAUBQLN1-Perlen (Packungsvolumen) inkubiert. Nach vier Wäschen mit Lysepuffer, der 1 M NaCl enthielt, und einer letzten Wäsche in 10 mM Tris (pH 8,0) wurden Proteine ​​vor der Analyse durch SDS-PAGE mithilfe von Probenpuffer aus Halo-4xUBAUBQLN1 freigesetzt. Für die cGAS- und E5R-Cotransfektion wurden HEK293T-Zellen in 10-cm-Platten mit V5-cGAS zusammen mit E5R-Flag oder pcDNA3.1 transfiziert. 24 Stunden später wurden die Zellen 6 Stunden lang mit MG132 (25 μg/ml) behandelt, bevor sie in Lysepuffer lysierten.

Für cGAS-Ubiquitinierungstests wurden HEK293T-Zellen in 10-cm-Platten mit V5-cGAS zusammen mit HA-Ub-WT oder HA-Ub-K48 transfiziert. 24 Stunden später wurden die Zellen 6 Stunden lang in Gegenwart von MG132 (25 μg/ml) mit MVA oder MVA∆E5R bei MOI 10 infiziert und 30 Minuten lang in RIPA-Lysepuffer (ThermoFisher, 89901) auf Eis lysiert. Anti-V5-Antikörper (ThermoFisher, R960-25) wurde dem Zelllysat bis zu einer Endkonzentration von 1 μg/ml zugesetzt und über Nacht bei 4 °C auf einem Rotator inkubiert. Am nächsten Tag wurden Protein-G-Magnetkügelchen (Bio-Rad, 161-4023) hinzugefügt und 2 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Die Perlen wurden fünfmal mit RIPA-Puffer gewaschen. Zuletzt wurden die an Perlen gebundenen Proteine ​​in SDS-Puffer durch 5-minütiges Erhitzen auf 98 °C denaturiert, bevor sie auf ein SDS-PAGE-Gel geladen wurden.

Für den cGAS- und E5-Interaktionstest wurden HEK293T-Zellen in 10-cm-Platten mit V5-cGAS zusammen mit E5R-Flag oder pcDNA3.1 transfiziert. Zwei Tage später wurden die Zellen 30 Minuten lang in Pierce IP-Lysepuffer auf Eis lysiert. Zelllysate wurden mit oder ohne 250 U/ml Benzonase (Sigma, E8263) 30 Minuten lang bei 4 °C behandelt, bevor sie mit Protein-G-Agarose (ThermoFisher, 20399) gemischt wurden. In BMDCs wurden Zellen 6 Stunden lang mit MVA∆E5R-E5R-Flag bei einer MOI von 10 infiziert. Die Zellen wurden wie oben lysiert. cGAS-Antikörper (Abcam, ab252416) wurde dem Zelllysat bis zu einer Endkonzentration von 1 μg/ml zugesetzt und über Nacht bei 4 °C auf einem Rotator inkubiert. Am nächsten Tag wurden Protein-G-Agarose-Kügelchen hinzugefügt und 2 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Die Perlen wurden fünfmal mit IP-Lysepuffer gewaschen. Zuletzt wurden die Proteine ​​im SDS-Puffer durch 5-minütiges Erhitzen auf 98 °C denaturiert, bevor sie auf die SDS-PAGE geladen wurden.

Die Gesamt-RNA wurde aus Ganzzelllysaten mit TRIzol-Reagenz (Invitrogen) oder mit dem RNeasy Plus Mini-Kit (Qiagen) extrahiert. RNAs wurden revers transkribiert und durch PCR unter Verwendung des Verso-cDNA-Synthesekits (Thermo Fisher) und des SYBRTM Green Master Mix (Thermo Fisher) amplifiziert. Zelluläre RNAs wurden auf GAPDH-Spiegel normalisiert. Die GAPDH-Spiegel waren in BMDCs unter Virusinfektion stabil43. Die ΔΔCt-Methode wurde verwendet, um die Expression von Genen zu messen, und die Effizienz der qPCR-Assays lag zwischen 90 % und 110 %72. Alle Tests wurden auf einem ABI 7500-System durchgeführt und mit der ABI 7500 SDS-Software v.1.3 (Applied Biosystems) analysiert und folgten MIQE73. Die Datenverteilung wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test bewertet. Primersequenzen sind in Tabelle S1 aufgeführt.

cGAMP wurde wie zuvor berichtet durch LC-MS gemessen74. Kurz gesagt, Zellpellets wurden mit 80 fmol internen Standards (15N10-cGAMP, selbst hergestellt) ergänzt und anschließend in 80 % Methanol und 2 % Essigsäure und zweimal in 2 % Essigsäure extrahiert, um einen Metabolitenextrakt zu erhalten. cGAMP wurde aus kombinierten Extrakten auf HyperSep Aminopropyl SPE-Säulen (Thermo Scientific) angereichert. Nach zweimaligem Waschen in 2 %iger Essigsäure und einmal in 80 %igem Methanol wurden die Proben in 4 %igem Ammoniumhydroxid in 80 %igem Methanol eluiert. Vakuumgetrocknete Eluenten wurden in Wasser gelöst und auf einem Dionex U3000 HPLC gekoppelt mit einem TSQ Quantiva Triple Quadruple Massenspektrometer (Thermo Scientific) analysiert. Bei der Chromatographie wurde LUNA NH2-Harz (5 µm, Phenomenex) als stationäre Phase verwendet, verpackt in Silica-Kapillaren mit 0,1 mm ID × 70 mm L. Mobile Phasen sind Acetonitril (A), 20 mM Ammoniumbicarbonat und 20 mM wässrige Ammoniumhydroxidlösung (B). Die Flussrate beträgt 800 nL/min (0–4 Min.), 300 nL/min (4–19 Min.) und 600 nL/min (19–27 Min.), mit einem Gradienten von 20 % B (0–3 Min.). , 50 % B (4 Min.), 80 % B (14–18 Min.) und 20 % B (19–27 Min.). cGAMP und Standard wurden durch Mehrfachreaktionsüberwachung im positiven Modus mit den folgenden Übergängen analysiert: 675–136, 675–152, 675–476 und 675–524 für cGAMP; und 685-136, 685-157, 685-480 und 685-529 für den 15N10-cGAMP-Standard. Die endogenen cGAMP-Spiegel wurden berechnet, indem die cGAMP-zu-Standard-Verhältnisse mit 80 fmol (der Menge an Standard, die jeder Probe zugesetzt wurde) multipliziert wurden.

Mit GM-CSF kultivierte BMDCs (1 × 106) von WT- oder cGAS-/-Mäusen wurden mit MVA oder MVA∆E5R bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 infiziert. Die Zellen wurden 16 Stunden nach der Infektion gesammelt. Die Gesamt-RNA wurde zu den angegebenen Zeitpunkten aus den gesammelten Zellen mit dem RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert, einschließlich DNase I-Behandlung. Die Gesamt-RNA-Integrität wurde mit einem 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) analysiert. Messenger-RNA wurde mit dem TruSeq Stranded-mRNA-Probenbibliotheksvorbereitungskit (Illumina, San Diego, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Die normalisierten endgültigen cDNA-Bibliotheken wurden gepoolt und auf dem Illumina NovaSeq6000-Sequenzierer mit 50 Paar-End-Zyklen sequenziert. Die rohen Sequenzierungslesevorgänge im BCL-Format wurden über bcl2fastq 2.19 (Illumina) zur FASTQ-Konvertierung und Demultiplexierung verarbeitet. Nach dem Zuschneiden der Adapter mit Cutadapt (Version 1.18) wurden die RNA-Reads durch STAR (Version 2.5.2) abgeglichen und auf das menschliche Referenzgenom GRCh38 abgebildet, und die Transkriptomrekonstruktion wurde durch Cufflinks (Version 2.1.1) durchgeführt. Die Häufigkeit der Transkripte wurde mit Manschettenknöpfen in Fragmenten pro Kilobase des Exon-Modells pro Million zugeordneter Lesevorgänge (FPKM) gemessen. Mit dem DESeq2-Paket wurden Genexpressionsprofile für differenzielle Expressions-, Cluster- und Hauptkomponentenanalysen erstellt. Die GSEA-Software des Broad Institute wurde verwendet, um Funktionen unterschiedlich exprimierter Gene zu identifizieren. Die Gene wurden anhand des log2-FC-Werts eingestuft, der aus der Analyse der differentiellen Expression erhalten wurde, und die voreingestellte Version des Tools wurde verwendet, um signifikant angereicherte biologische Signalwege zu identifizieren. Heatmaps deutlich angereicherter biologischer Pfade wurden mit dem R-Paket pheatmap (https://www.rdocumentation.org/packages/pheatmap/versions/1.0.12/topics/pheatmap) erstellt.

Vulkandiagramme wurden mit dem R-Paket EnhancedVolcano (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/EnhancedVolcano.html) erstellt.

Die RNA-Seq-Daten für dieses Projekt wurden im Gene Expression Omnibus des NCBI unter der Zugangsnummer GSE185431 hinterlegt.

Für den Vergleich zweier Gruppen in den Studien wurde der zweiseitige, ungepaarte Student-t-Test verwendet. Die Überlebensdaten wurden mittels Log-Rank-Test (Mantel-Cox) analysiert. Die als signifikant erachteten p-Werte sind in den Abbildungen wie folgt angegeben: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Die Anzahl der in die Studie einbezogenen Tiere wird in der Legende jeder Abbildung erläutert.

Alle einzigartigen Materialien sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Die Verfügbarkeit des Antikörpers, der das VACV-Protein C7 erkennt, ist begrenzt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

RNAseq-Daten wurden im Gene Expression Omnibus (GEO) unter der Zugangsnummer GSE185431 hinterlegt. Alle anderen Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien verfügbar. Quelldaten werden in diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken der Flow Cytometry Core Facility und der Molecular Cytology Core Facility am Sloan Kettering Institute. Wir danken Dr. Charles Rice und Stewart Shuman für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse K-08 AI073736 (LD), R56AI095692 (LD), R03 AR068118 (LD), R35 GM132111 (HF) und den MSK Technology Development Fund (LD) sowie eine gesponserte Forschungsvereinbarung von IMVAQ Therapeutics (LD) unterstützt. und Cancer Prevention and Research Institute of Texas, RP180725 (ZJC). ZJC ist Forscher am Howard Hughes Medical Institute. Diese Forschung wurde teilweise auch durch den NIH/NCI Cancer Center Support Grant P30 CA008748 finanziert.

Christian Zierhut

Aktuelle Adresse: The Institute of Cancer Research, London, SW3 6JB, UK

Dermatologischer Dienst, Abteilung für Medizin, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, 10065, USA

Ning Yang, Yi Wang, Peihong Dai und Liang Deng

Abteilung für Molekularbiologie, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, 75390, USA

Tuo Li & Zhijian Chen

Labor für Chromosomen- und Zellbiologie, Rockefeller University, New York, NY, 10065, USA

Christian Zierhut & Hironori Funabiki

Genomic Resources Core Facility, Weill Cornell Medical College, New York, NY, 10065, USA

Adrian Tan, Tuo Zhang und Jenny Zhaoying Xiang

Zellbiologieprogramm, Sloan Kettering Institute, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, 10065, USA

Alban Ordureau

Programm für Humanonkologie und Pathogenese, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, 10065, USA

Liang Deng

Weill Cornell Medical College, New York, NY, 10065, USA

Liang Deng

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Beiträge der Autoren: NY und LD waren an allen Aspekten dieser Studie beteiligt, einschließlich der Konzeption des Projekts, der Gestaltung und Durchführung von Experimenten, der Datenanalyse und -interpretation sowie dem Verfassen von Papieren. NY entwarf das Screening auf Vaccinia-Inhibitoren des zytosolischen DNA-Sensorwegs und führte die meisten Experimente durch. YW unterstützte NY beim Screening und der Validierung von Vaccinia-Inhibitoren. YW und LD führten RNA-seq-Experimente durch. YW und LD erzeugten verschiedene VACV-E5-Deletionsviren und führten Pathogenesestudien durch. PD und TL sind an der cGAMP-Messung in BMDCs beteiligt, die mit Vaccinia und MVA infiziert sind. AT, TZ und JZX analysierten RNA-seq-Daten und halfen bei der Manuskripterstellung. CZ, HF, AO und ZJC halfen bei der experimentellen Gestaltung, Dateninterpretation und Manuskripterstellung. LD übernahm die Gesamtüberwachung des Projekts.

Korrespondenz mit Ning Yang oder Liang Deng.

Das Memorial Sloan Kettering Cancer Center hat einen Patentantrag für die Entdeckung von Vaccinia-Virus-Inhibitoren des zytosolischen DNA-Sensorwegs und deren Verwendung zur Verbesserung von MVA und Vaccinia als onkolytische Wirkstoffe und Impfstoffvektoren eingereicht. Das Patent wurde an IMVAQ Therapeutics lizenziert. LD und NY sind Mitbegründer von IMVAQ Therapeutics. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt François Meurens, Luis Sigal und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yang, N., Wang, Y., Dai, P. et al. Vaccinia E5 ist ein wichtiger Inhibitor des DNA-Sensors cGAS. Nat Commun 14, 2898 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38514-5

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Eingegangen: 02. Juni 2022

Angenommen: 05. Mai 2023

Veröffentlicht: 22. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38514-5

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