Der SnRK2.3

Naturpflanzen (2023)Diesen Artikel zitieren

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Lösliche Zucker sind die Kernbestandteile der Fruchtqualität, und der Grad der Zuckeranreicherung wird weitgehend durch im Tonoplast lokalisierte Zuckertransporter bestimmt. Wir haben zuvor gezeigt, dass zwei Klassen von Tonoplasten-Zuckertransportern, MdERDL6 und MdTST1/2, die Zuckeransammlung in Vakuolen koordiniert regulieren. Der dieser Koordination zugrunde liegende Mechanismus bleibt jedoch unbekannt. Hier haben wir entdeckt, dass zwei Transkriptionsfaktoren, MdAREB1.1/1.2, die MdTST1/2-Expression regulieren, indem sie ihre Promotoren im Apfel binden. Die verstärkte MdAREB1.1/1.2-Expression in Pflanzen mit MdERDL6-1-Überexpression führte zu einem Anstieg der MdTST1/2-Expression und der Zuckerkonzentration. Weitere Studien ergaben, dass MdSnRK2.3, dessen Expression durch die Expression von MdERDL6-1 reguliert werden könnte, mit MdAREB1.1/1.2 interagieren und dieses phosphorylieren kann, wodurch die MdAREB1.1/1.2-vermittelte Transkriptionsaktivierung von MdTST1/2 gefördert wird. Schließlich zeigten die orthologen SlAREB1.2 und SlSnRK2.3 in Tomatenfrüchten ähnliche Funktionen wie in ihren Apfel-Gegenstücken. Zusammengenommen liefern unsere Ergebnisse Einblicke in den Regulierungsmechanismus des tonoplastischen Zuckertransports, der von SnRK2.3-AREB1-TST1/2 für die Anreicherung von Fruchtzucker ausgeübt wird.

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Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Haupttext oder in den Zusatzinformationen verfügbar. Weitere Daten zu dieser Studie sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Alle in dieser Studie verwendeten biologischen Materialien sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Zhu, L. et al. Der durch MdERDL6 vermittelte Glukoseausfluss in das Zytosol fördert die Zuckerakkumulation in der Vakuole durch Hochregulierung der TSTs in Äpfeln und Tomaten. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 118, e2022788118 (2021).

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Wir danken J. Zhang und J. Zhao (Horticulture Science Research Center, Northwest A&F University, Yangling, China) für die professionelle technische Unterstützung bei der GC-MS-Analyse; H. Zhao und F. Yuan (State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Northwest A&F University, Yangling, China) und Y. Yuan und R. Chen (Horticulture Science Research Center, Northwest A&F University, Yangling, China) für Bereitstellung von experimenteller Unterstützung in der konfokalen Mikroskopie. Diese Arbeit wurde vom Programm der National Natural Science Foundation of China (31872043) an ML, dem Shaanxi Science and Technology Innovation Team Project (2022TD-18) an ML, dem Australian Research Council (DP180103834) an Y.-LR unterstützt. und der Zweckgebundene Fonds für das China Agriculture Research System (CARS-27) an FM

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Lingcheng Zhu, Yanzhen Li.

Staatliches Schlüssellabor für Pflanzenstressbiologie in Trockengebieten/Shaanxi-Schlüssellabor von Apple, College of Horticulture, Northwest A&F University, Xianyang, China

Lingcheng Zhu, Yanzhen Li, Chengcheng Wang, Zhiqi Wang, Wenjing Cao, Jing Su, Yunjing Peng, Baiyun Li, Baiquan Ma, Fengwang Ma, Yong-Ling Ruan und Mingjun Li

College of Life Science, Northwest A&F University, Xianyang, China

Lingcheng Zhu

Abteilung für Pflanzenwissenschaften, Research School of Biology, The Australian National University, Canberra, Australian Capital Territory, Australien

Yong-Ling Ruan

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LZ, ML, FM und Y.-LR haben diese Forschung entworfen. LZ, YL, CW, ZW, JS, YP, BL, WC und BM führten die Experimente durch. LZ, JS, YL, ML und Y.-LR analysierten die Daten. LZ, ML und Y.-LR haben den Artikel geschrieben. ML und FM überwachten die Studie. Alle Autoren haben die Abschlussarbeit gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Fengwang Ma, Yong-Ling Ruan oder Mingjun Li.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Plants dankt Jintao Cheng, Li-Qing Chen und H. Ekkehard Neuhaus für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, b, Relative Verteilung kompartimentspezifischer Marker in MdERDL6-1-überexprimierten Apfelblättern (a) und Tomatenfrüchten (b). Die Gewebe wurden mithilfe eines NAF-Verfahrens fraktioniert und die Aktivitäten der Markerenzyme in den fünf Fraktionen bestimmt. Die Daten werden als prozentuale Aktivitäten in jeder Fraktion ausgedrückt. AGPase, UGPase und ACP wurden als plastidische, zytosolische bzw. vakuoläre Marker verwendet. c, d: Subzelluläre Konzentrationen von Glc, Fru und Suc in Plastid-, Zytosol- und Vakuolenfraktionen von MdERDL6-1 überexprimierten Apfelblättern (c) und Tomatenfrüchten (d). nd, keine Daten. Die Balken stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 3 unabhängige biologische Replikate). Die Sternchen in (c,d) geben signifikante Unterschiede an, die durch den Student-t-Test (zweiseitig) ermittelt wurden. ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05, ns, nicht signifikant.

Quelldaten

a: Differenziell exprimierte Transkriptionsfaktoren in der RNA-Sequenz von transgenen MdERDL6-1-Äpfeln. Der Schwellenwert wurde wie folgt festgelegt: RPKM > 1, Fold Change > 1,5. b, c: Vorhergesagte aktive Transkriptionsfaktoren regulieren die Expression von MdTST1 (b) und MdTST2 (c) basierend auf ATAC-seq in Apfelfrüchten. d, Die ABRE-Elementanalyse auf MdTST1/2-Promotoren. e, qRT-PCR-Validierung von drei unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren in der RNA-Sequenz von transgenen MdERDL6-1-Äpfeln. Die Transkriptwerte wurden mit denen von MdActin in transgenen Äpfeln normalisiert. Die relativen Expressionsniveaus für jedes Gen wurden mithilfe der ddCT-Methode ermittelt, wobei die Expression im Wildtyp (WT) auf „1“ gesetzt wurde. Die Balken stellen den Mittelwert ± SD (n = 3 Sämlinge) dar. Die Sternchen in (e) geben signifikante Unterschiede an, die durch den Student-t-Test (zweiseitig) ermittelt wurden. ***P < 0,001, **P < 0,01, ns, nicht signifikant.

Quelldaten

a, b, Die Auswirkungen der Zuckerfütterung auf die Expressionsniveaus von MdSnRK2.3 und MdAREB1.1/1.2. Apfelkalli wurden auf MS-Flüssigmedium mit 2 % verschiedenen exogenen Zuckern (Wasser wurde als Kontrolle verwendet) und unterschiedlichen Glc-Konzentrationen 24 Stunden lang kultiviert, und die Genexpressionsniveaus wurden durch qRT-PCR nachgewiesen. Die Transkriptmengen wurden mit denen von MdActin normalisiert. Das relative Expressionsniveau wurde mit der ddCT-Methode ermittelt, wobei das Expressionsniveau bei der Wasserfütterung auf „1“ gesetzt wurde. c, d, Die Auswirkungen der Zuckerfütterung auf die MdAREB1.1/1.2-Promoteraktivitäten. Apfelkalli wurden 24 Stunden lang auf MS-Flüssigmedium mit verschiedenen exogenen Zuckern und unterschiedlichen Glc-Konzentrationen kultiviert, nachdem sie mit Agrobacterium infiltriert worden waren, das MdAREB1.1/1.2pro-GUS-Plasmide enthielt. Die behandelten und Kontroll-Apfelkalli wurden nach 24-stündiger Fütterung für den GUS-Aktivitätstest geerntet. Die 1924-bp- und 1937-bp-Promotoren von MdAREB1.1 und MdAREB1.2 wurden in den GUS-Experimenten verwendet. Mann: Mannose; Glc: Glucose; Fru: Fruktose; Suc: Saccharose; und Sor: Sorbitol. Balken stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 3 unabhängige biologische Replikate). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin, die jeweils anhand der einfaktoriellen ANOVA (Tukey-Test) ermittelt wurden (P < 0,05).

Quelldaten

a, Phylogenetischer Baum von MdAREBs aus Apfel und den orthologen Genen aus Arabidopsis und Tomate. Die orthologen AREB-Sequenzen wurden gesammelt, um mithilfe der Neighbour-Joining-Methode der MEGA7-Software einen wurzellosen phylogenetischen Baum zu erstellen. Um verlässliche Schätzungen für die phylogenetische Baumtopologie zu erhalten, wurde ein 1000-minütiger Bootstrap-Analyseversuch durchgeführt. Die farbigen Kreise sind die in dieser Forschung untersuchten Gene. Der Maßstabsbalken entspricht 0,05. b, Kernlokalisierung von MdAREB1.1/1.2. 35Spro:MdAREB1.1/1.2-GFP wurde vorübergehend in Protoplasten von Arabidopsis-Blättern exprimiert. DAPI diente als Kernfarbstoff. Die GFP-Signale von MdAREB1.1/1.2 überlappten mit DAPI, was darauf hinweist, dass MdAREB1.1/1.2 im Kern lokalisiert war. Maßstabsbalken, 20 μm. c, Der transkriptionelle Selbstaktivierungstest von MdAREB1.1/1.2. Der pGBKT7-MdAREB1.1/1.2 und der leere pGBKT7-Vektor (Negativkontrolle) wurden jeweils in den Hefestamm Y2H eingeführt und die transformierten Zellen wurden auf SD-Trp- und SD-Trp-His-Leu+x-α-Gal-Medium getupft . Die Platten wurden 3 Tage lang bei 30 °C inkubiert. d, Die Wärmekarte der MdAREBs-Expressionsniveaus basierend auf RNA-Seq in reifen Blättern (ML) und fünf Stadien der Fruchtentwicklung (S1-S5). Die Faltungsdifferenz wird als log2-Wert bezeichnet, wobei die Daten in S1 auf 1 gesetzt sind. Die Experimente in (b, c) wurden unabhängig voneinander mindestens dreimal wiederholt, mit ähnlichen Ergebnissen.

Quelldaten

a, Die vollständigen kodierenden Sequenzen von MdAREB1.1 oder MdAREB1.2 wurden in den pMDC83-Vektor für eine genstabile Überexpression eingefügt (OE-MdAREB1.1#1, #2; OE-MdAREB1.2#1, #2), während die Spezifische cDNA-Fragmente wurden zur genstabilen Stummschaltung in den pK7GWIWG2-Vektor kloniert (PK7-MdAREB1.1#1, #2; PK7-MdAREB1.2#1, #2). Die leeren Vektoren pMDC83 und PK7 dienten jeweils als Kontrollen. b, Die relativen mRNA-Expressionsniveaus von MdAREB1.1/1.2 und MdTST1/2 in transgenen Apfelkalli, wobei das Niveau von pMDC83 auf „1“ gesetzt wird. c, Die Zuckerkonzentrationen (Fru, Fructose; Glc, Glucose; Suc, Saccharose) in transgenen Apfelkalli. Die Balken stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 3 unabhängige biologische Replikate). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin, wie durch eine einfaktorielle ANOVA (Tukey-Test) bewertet (P < 0,05).

Quelldaten

a, Phylogenetische Analyse von MdSnRK2s aus Äpfeln und den orthologen Genen aus Arabidopsis und Tomaten. Die orthologen SnRK2s-Sequenzen wurden gesammelt, um mithilfe der Neighbor-Joining-Methode der MEGA7-Software einen wurzellosen phylogenetischen Baum zu erstellen, der offensichtlich in drei Unterklassen gruppiert wurde. Um verlässliche Schätzungen für die phylogenetische Baumtopologie zu erhalten, wurde ein 1000-minütiger Bootstrap-Analyseversuch durchgeführt. Die farbigen Kreise sind die in dieser Forschung untersuchten Gene. Der Maßstabsbalken entspricht 0,05. b, Die Heatmap der MdSnRK2s-Expressionsniveaus basierend auf RNA-seq in MdERDL6-1 überexprimierenden Apfellinien. Die Faltungsdifferenz wird als log2-Wert bezeichnet, wobei die Daten im WT auf 1 eingestellt sind. c, Die Proteinhäufigkeiten (quantifizierte Proteine) von MdSnRK2.1/2.3/2.5 werden aus der quantitativen Tandem-Mass-Tags-Proteomik (TMT) von fünf Entwicklungsstadien extrahiert von Apfelfrüchten. Die Balken stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 3 unabhängige biologische Replikate). d, Subzelluläre Lokalisierung des MdSnRK2.3-GFP-Fusionsproteins in den Protoplasten von Arabidopsis-Blättern. GFP, grün fluoreszierendes Protein. Zur Färbung des Zellkerns wurde DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol) verwendet. Auto, die rote Autofluoreszenz von Chloroplasten. Balken = 20 μm. Die Experimente in (d) wurden unabhängig voneinander mindestens dreimal wiederholt, mit ähnlichen Ergebnissen.

Quelldaten

a, b: Hefe-One-Hybrid-Assays zeigten, dass MdAREB1.1/1.2 und SlAREB1.2 an ihre eigenen Promotoren banden, die ABRE-cis-Elemente enthielten. Schematische Darstellung der P1- und P2-Verkürzungspromotoren mit oder ohne ABRE-cis-Elemente; die vertikalen Linien stellen ABRE-cis-Elemente dar (a). Die Positivkontrollen waren pAbAi-P53 und pGADT7-53. Die Screening-Konzentration von AbA betrug 150 ng/ml, 180 ng/ml bzw. 200 ng/ml der Promotoren MdAREB1.1, MdAREB1.2 und SlAREB1.2. Jede Kolonie wurde in 5 μl sterilem NaCl gelöst und dann auf 10–1 bis 10–3 verdünnt. c: Dual-Luciferase-Assays in Tabakblättern (N. benthamiana) ergaben, dass MdAREB1.1/1.2 und SlAREB1.2 an ihre eigenen Promotoren binden. Links sind die Dual-Luciferase-Signalbilder und rechts sind Dual-Luciferase-Aktivitätstests. In diesem Test wurden die 1924-bp- und 1937-bp-Promotoren von MdAREB1.1 und MdAREB1.2 sowie der 1911-bp-Promotor von SlAREB1.2 verwendet. Die Positivkontrollen sind pGreenII 0800-LUC-P53 und pGreenII 62-SK-53. Die Experimente wurden unabhängig voneinander mindestens dreimal wiederholt, mit ähnlichen Ergebnissen.

a, Die Früchte transgener Tomatenlinien (Überexpressionslinien: OE#2, OE#5; Stillelinien: PK7#1, PK7#3). b, c: Die relativen Expressionsniveaus von SlAREB1.2 und SlTST1/2 in der transgenen Tomate, gemessen mit qRT-PCR und normalisiert auf die von SlActin, wobei das von WT auf „1“ gesetzt wird. d, e, Der Gehalt an löslichen Feststoffen und der Kohlenhydratgehalt in reifenden Früchten transgener Tomaten. Glc, Glucose; Fru, Fruktose; Suc, Saccharose. Die Balken stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 3 unabhängige biologische Replikate). Die Sternchen geben signifikante Unterschiede an, die durch den Student-t-Test (zweiseitig) ermittelt wurden. ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05.

Quelldaten

a, Das Agrobacterium, das die resultierenden Vektoren pTRV2-SlAREB1.2 und pTRV1 enthielt, wurde zu gleichen Anteilen gemischt und zur Injektion in zwei MdERDL6-1 überexprimierende Tomatenlinien (OE1-pTRV#SlAREB1.2 und OE2-pTRV#SlAREB1.2) verwendet ), mit leerem pTRV2- und pTRV1-Gemisch zur Injektion als Kontrollen (WT, OE-1 und OE-2). Die Pfeile zeigen die Injektionsstellen in Früchten an. b, Die mRNA-relativen Expressionsniveaus von SlAREB1.2 und SlTST1/2 in transgenen Tomatenfrüchten mit Wildtyp- und MdERDL6-1-überexprimiertem Hintergrund, wobei diese aus WT auf „1“ gesetzt werden. c, Die Zuckerkonzentrationen (Fru, Fructose; Glc, Glucose; Suc, Saccharose) in transgenen Tomatenfrüchten mit Wildtyp- und MdERDL6-1-überexprimiertem Hintergrund. Die Balken stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 3 unabhängige biologische Replikate). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin, wie durch eine einfaktorielle ANOVA (Tukey-Test) bewertet (P < 0,05).

Quelldaten

a: Das Agrobacterium, das die resultierenden Vektoren pTRV2-SlSnRK2.3 und pTRV1 enthielt, wurde zu gleichen Anteilen gemischt und zur Injektion in zwei MdERDL6-1 überexprimierende Tomatenlinien (OE1-pTRV#SlSnRK2.3 und OE2-pTRV#SlSnRK2.3) verwendet ), mit leerem pTRV2- und pTRV1-Gemisch zur Injektion als Kontrollen (WT, OE-1 und OE-2). Die Pfeile zeigen die Injektionsstellen in Früchten an. b, Die relativen mRNA-Expressionsniveaus von SlSnRK2.3, SlAREB1.2 und SlTST1/2 in transgenen Tomatenfrüchten mit Wildtyp- und MdERDL6-1-überexprimiertem Hintergrund, wobei diese aus WT auf „1“ gesetzt werden. c, Die Zuckerkonzentrationen (Fru, Fructose; Glc, Glucose; Suc, Saccharose) in transgenen Tomatenfrüchten mit Wildtyp- und MdERDL6-1-überexprimiertem Hintergrund. Die Balken stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 3 unabhängige biologische Replikate). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin, wie durch eine einfaktorielle ANOVA (Tukey-Test) bewertet (P < 0,05).

Quelldaten

Ergänzende Abbildungen. 1–9 und Tabellen 1–6.

Statistische Quelldaten und unverarbeitete Western Blots.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Unverarbeitete Western Blots.

Unbehandelte Western Blots und Gele.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten und unverarbeitete Western Blots.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhu, L., Li, Y., Wang, C. et al. Die durch zytosolische Glukose aktivierte SnRK2.3-AREB1-TST1/2-Kaskade reguliert die Zuckeransammlung über Tonoplasten in Äpfeln und Tomaten. Nat. Pflanzen (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-023-01443-8

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Eingegangen: 09. Dezember 2022

Angenommen: 12. Mai 2023

Veröffentlicht: 08. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-023-01443-8

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