Altersbedingte Störung des Fettstoffwechsels | Beijing Eastern Sunrise Co., Ltd

Signal Transduction and Targeted Therapy Band 7, Artikelnummer: 162 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Epigenetische Veränderungen und Stoffwechselstörungen sind zwei Kennzeichen des Alterns. Der Mechanismus, wie ihr Zusammenspiel das Altern, insbesondere bei Säugetieren, reguliert, ist jedoch noch weitgehend unbekannt. Hier zeigen wir, dass ELOVL-Fettsäure-Elongase 2 (Elovl2), ein Gen, dessen epigenetische Veränderungen am stärksten mit der Altersvorhersage korrelieren, durch die Regulierung des Lipidstoffwechsels zum Altern beiträgt. Wir haben künstliche Intelligenz eingesetzt, um die Proteinstruktur von ELOVL2 und die Interaktion mit seinem Substrat vorherzusagen. Eine beeinträchtigte Elovl2-Funktion stört die Lipidsynthese mit erhöhtem Stress im endoplasmatischen Retikulum und mitochondrialer Dysfunktion, was zu wichtigen Alterungsphänotypen sowohl auf zellulärer als auch auf physiologischer Ebene führt. Darüber hinaus kann die Wiederherstellung der mitochondrialen Aktivität Phänotypen der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) retten, die durch einen Elovl2-Mangel in menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) hervorgerufen werden. Dies deutet auf einen konservativen Mechanismus sowohl beim Menschen als auch bei der Maus hin. Zusammenfassend haben wir eine epigenetisch-metabolische Achse aufgedeckt, die zum Altern beiträgt, und die Leistungsfähigkeit eines KI-basierten Ansatzes in Struktur-Funktions-Studien veranschaulicht.

Altern ist ein unvermeidlicher Lebensprozess, der durch eine zunehmende Anfälligkeit für Krankheiten, einen Verlust der molekularen Genauigkeit und einen fortschreitenden Rückgang der Gewebe- und Organfunktionen gekennzeichnet ist.1 Epigenetische Veränderungen spielen eine Schlüsselrolle beim Altern, indem sie Umweltsignale integrieren, um die Genexpression und nachgelagerte zelluläre Prozesse zu regulieren.2 ,3,4,5,6 Der integrale Zusammenhang zwischen Alterung und DNA-Methylierungsgraden wurde bis vor kurzem nicht klar beschrieben,7,8,9,10 Mehrere hundert CpG-Stellen mit DNA-Methylierungsgraden, die mit dem biologischen Alter korrelieren, wurden genau kartiert.6,11 Studien mehrerer Gruppen etablierten epigenetische DNA-Methylierungssignaturen12, die als genaue „Uhr“ des biologischen Alters in vielen verschiedenen Gewebetypen dienen können13 (siehe aktuelle Übersicht von Bell et al.14), von denen einige in stoffwechselassoziierten Genen gefunden wurden, was auf eine Intimität hinweist Zusammenhang zwischen epigenetischen Veränderungen und Stoffwechsel im Alter.

Elovl2, ein Gen, das als Hauptkontrolle der Synthese mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFA) fungiert und stark mit Diabetes assoziiert ist, zeigt die größte Relevanz für das Altern.4,11,15,16 Der DNA-Methylierungsstatus von Elovl2 erklärt 70 % davon die „alternde epigenetische Uhr“.15 Mehrere CG-Marker, darunter Elovl2, sagen das Altern in verschiedenen Geweben voraus15,17 und werden als universelle Bioage-Marker bezeichnet,15,17 wohingegen die übrigen Marker normalerweise gewebespezifisch sind und bei der Alterungsvorhersage weniger Gewicht haben. Funktionell spielt Elovl2 eine unersetzliche Rolle bei der Synthese von PUFAs, die für eine Reihe biologischer Prozesse von entscheidender Bedeutung sind. Es wurde berichtet, dass die Konzentration von PUFAs im Körper, einschließlich ihrer Seitenketten und Nebenprodukte, negativ mit dem Alter des Menschen korreliert.18,19 Obwohl die Rolle von Elovl2 bei der Synthese von PUFAs in früheren Studien gut dokumentiert wurde, Die Auswirkung eines Elovl2-Mangels auf das Altern oder der nachgeschaltete Mechanismus, der zugrunde liegt, wie altersbedingte Elovl2-DNA-Methylierung zum Altern beiträgt, ist weiterhin unbekannt.

Derzeit fehlen Informationen zur Proteinstruktur von ELOVL2 und anderen Mitgliedern der ELOVL-Familie. Dies schränkt unser Verständnis des Downstream-Mechanismus der physiologischen Funktion von ELOVL2 ein. Jüngste aufregende Erfolge bei KI-basierten 3D-Proteinstrukturvorhersagen haben eine neue Ära für das Lernen in Biologie und Medizin eingeläutet, indem sie schnelle Proteinstrukturvorhersagen ermöglichten und ein enormes Potenzial für Funktionsstudien bieten.20,21 Wir haben diesen Ansatz angewendet, um ELOVL2 und seine Interaktion vorherzusagen und zu verstehen mit Substraten und gewinnen Sie Einblick in deren Funktionen.

Wir kamen außerdem zu dem Schluss, dass eine Abnahme der Elovl2-Expression zum Altern beiträgt, indem sie das Gleichgewicht des Lipidstoffwechsels in ER und Mitochondrien stört. Einerseits ist Elvol2 im endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiert, wo PUFAs verlängert sind. Andererseits sind Mitochondrien der Hauptort des Lipidabbaus, an dem die Oxidation von Fettsäuren stattfindet. Beide spielen eine wichtige Rolle beim Fettstoffwechsel und beim Altern. Hier zeigen wir, dass ein Mangel an Elovl2 zu einem Rückgang der PUFA-Synthese und der Ansammlung kurzer Fettsäuren, einschließlich PUFA-Vorläufern, im ER führt, was zu einer Veränderung des mitochondrialen Energiestoffwechsels führt und zu chronischem ER-Stress und Mitochondrien-Funktionsstörungen führt. Diese Veränderungen trugen zu Alterungsphänotypen bei, darunter Stammzellerschöpfung, kognitiver Verfall, Netzhautdegeneration und Glukoseintoleranz. Wir haben diesen Mechanismus auch in einem menschlichen RPE-Zellmodell angewendet und einen Rettungsphänotyp beobachtet. In diesem Artikel haben wir eine epigenetisch-metabolische Achse aufgedeckt, die zum Altern beiträgt, und die Leistungsfähigkeit eines KI-basierten Ansatzes in Struktur-Funktions-Studien veranschaulicht.

Wir und andere haben über eine Gruppe von Genen bei Menschen und Mäusen berichtet, deren DNA-Methylierungsgrad mit dem physiologischen Alterungsstatus zusammenhängt; Folglich können diese Gene als Prädiktoren für das biologische Alter dienen.6,11 In Übereinstimmung mit früheren Berichten4,11,15 beobachteten wir, dass Gene, die mit der Speicherung von Fetten, dem Fettsäurestoffwechsel und der Lipogenese in Zusammenhang stehen, in der Gene Ontology (GO)-Termanalyse von aufgedeckt wurden Top-relevante Prädiktorgene. Wir haben die Genliste der Top-Prädiktorgene analysiert. Unter den Top-Prädiktorgenen zeigte der Elovl2-Locus die signifikanteste Relevanz für das biologische Alter (Abb. 1a und ergänzende Abb. 1a). Um den mechanistischen Zusammenhang zwischen altersbedingten Genen und Alterungsprozessen zu untersuchen, haben wir sowohl Menschen- als auch Mausmodelle etabliert. Ein ähnliches altersbedingtes DNA-Methylierungsmuster wurde im menschlichen In-vitro-Zellmodell und im Maus-in-vivo-Modell bestätigt. Mithilfe eines menschlichen Fibroblastenzellmodells wurde in gealterten menschlichen Fibroblasten (38 Passagen) ein dramatischer Anstieg der DNA-Methylierung auf Elovl2, begleitet von einem herunterregulierten Elovl2-Expressionsniveau, festgestellt (Abb. 1b). Als nächstes untersuchten wir CpG-Inseln innerhalb des Elovl2-Gens in verschiedenen Mausgeweben unterschiedlichen Alters: CGI-I1 im ersten Intron und CGI-E3, E4 und E8 im 3., 4. und 8. Exon (ergänzende Abbildung 1b). Wir fanden heraus, dass die DNA-Methylierung von CGI-I1, E3, E4 und E8 in Gehirn und Leber mit zunehmendem Alter bei 129/sv-Stämmen signifikant zunahm (Abb. 1c und ergänzende Abb. 1c, d). Außerdem zeigte die qPCR-Analyse, dass das Expressionsniveau von Elovl2 mit zunehmendem Alter bei 129/sv-Mäusen abnahm (ergänzende Abbildung 1e). Beim ICR-Mausstamm wurde ein konsistentes Ergebnis beobachtet (ergänzende Abbildung 1c – e). Diese Ergebnisse zeigten, dass Elovl2-Loci sowohl im menschlichen Fibroblastenzellmodell als auch im Mausmodell ein konserviertes Muster erhöhter DNA-Methylierung und verringerter Expression zeigten.

Elovl2 ist ein Stoffwechselgen, das als Marker für das Altern dient. a Zusammenhang zwischen DNA-Methylierung von Genen und Alterung. Die bedeutenden Standorte sind markiert. Das Alterungsmodell wurde in unserer vorherigen Arbeit beschrieben.11 p-Werte basieren auf einem Modell der kleinsten Quadrate, das mit denselben Termen und Drop-One-F-Tests erstellt wurde. b MeDip-qPCR und qPCR von Elovl2 in menschlichen Fibroblasten (n = 3). Fehlerbalken, Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Die Signifikanzniveaus wurden mit dem einseitigen Student-t-Test berechnet. Die Expression und DNA-Methylierung basiert auf denselben Zellplatten, die mit derselben Farbe eingefärbt sind. c DNA-Methylierungsgrad auf der CpG-Insel in Intron 1 (CGI-I1) von Elovl2 im Gehirn und in der Leber von 129/sv-Mäusen. Für jede Gruppe wurden 30 Sanger-Sequenzierungsergebnisse von sechs Mäusen verwendet. Fehlerbalken, REM. Die Signifikanzniveaus wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test berechnet. d Beta-Galactosidase (β-GAL)-Färbung an jungen (p5) menschlichen Fibroblasten mit oder ohne Behandlung mit Wasserstoffperoxid (H2O2) (n = 3). Maßstabsbalken, 100 µm. Die Signifikanzniveaus wurden mit dem einseitigen Student-t-Test berechnet. e qPCR, das die Transkriptionsveränderungen zellulärer Seneszenzmarker in normalen und mit H2O2 behandelten menschlichen Fibroblasten zeigt (n = 3). Fehlerbalken, REM. Die Signifikanzniveaus wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test berechnet. f MeDip-qPCR von Elovl2 in mit H2O2 behandelten menschlichen Fibroblasten (n = 3). Fehlerbalken. Die Signifikanzniveaus wurden mit dem einseitigen Student-t-Test berechnet. g Co-Immunpräzipitation an menschlichen Fibroblasten mit oder ohne H2O2-Behandlung. h Western Blot zeigt, dass die H2O2-induzierte Anreicherung von DNMTs an den Chromatinen CHD4-abhängig war. i Die Rekrutierung von CHD4 und 5mC an DNA-Schadensstellen von Zellen, die mit einem 450-nm-Laser bestrahlt wurden. Maßstabsbalken, 5 µm. Für jede Gruppe wurden 30 Zellen behandelt. 26 von 30 Zellen in der Kontrollgruppe zeigen eine Co-Lokalisierung von CDH4 und 5mC an der γ-H2A.X-Stelle, während 28 von 30 Zellen in der iCDH4-Gruppe keine Akkumulation von CDH4 und 5mC an der γ-H2A.X-Stelle aufweisen

Als nächstes untersuchten wir, wie Umweltfaktoren während des Alterungsprozesses die DNA-Methylierung von Elovl2 beeinflussen. Es wurde argumentiert, dass DNA-Schäden einer der wichtigsten Treiber des Alterns sind.3,22,23 Ein früherer Bericht zeigte, dass das Chromodomänen-Helikase-DNA-bindende Protein 4 (CHD4), eine Schlüsselkomponente des Nukleosomen-Remodellings und der Histon-Deacetylierung (NuRD), ist )-Komplex spielt eine zentrale Rolle bei der durch die Reparatur von DNA-Schäden vermittelten Gen-Stummschaltung in Krebszellen.24 Wir stellten daher die Hypothese auf, dass altersbedingte DNA-Methylierung auch durch DNA-Schäden und deren Reparaturprozess vermittelt werden könnte. Als Alterungsmodell verwendeten wir mit Wasserstoffperoxid (H2O2) behandelte menschliche Fibroblastenzellen. Nach H2O2-Behandlung (100 μM/24 h) zeigten menschliche Fibroblastenzellen einen signifikanten Anstieg der Seneszenzmarker (Abb. 1d, e). Dieser Phänotyp steht im Einklang mit den seneszenten Genexpressionsmustern in Zellen mit hoher Passagenzahl (30–40 Passagen) (Abb. 1d, e und ergänzende Abb. 1f, g). Darüber hinaus wurde die erhöhte DNA-Methylierung von Elovl2 in mit H2O2 behandelten Zellen beobachtet (Abb. 1f), was darauf hinweist, dass die DNA-Methylierung sowohl in mit H2O2 behandelten Zellen als auch in Zellen mit hoher Passagenzahl auftrat (Abb. 1d). Als nächstes untersuchten wir, ob CHD4 mit DNA-Methyltransferasen (DNMTs) und Chromatin-Unterdrückungsmodifikatoren interagieren könnte, um eine abnormale DNA-Methylierung in den mit H2O2 behandelten Fibroblastenzellen zu vermitteln. Co-Immunpräzipitationstests zeigten, dass CHD4, eine Schlüsselkomponente des NuRD-Komplexes, nach der H2O2-Behandlung signifikant mit DNMTs interagierte (Abb. 1g). Western Blot zeigte außerdem, dass die Bindung von DNMTs an Chromatin durch H2O2-Behandlung gefördert wurde (Abb. 1h, Tight Chromatin, Kontrolle), aber durch CHD4-Knockdown verringert wurde (Abb. 1h, Tight Chromatin, iCHD4, wo das Typ-B-Kernlamin ( Lamin B fungiert als Positivkontrolle und die zytoplasmatische Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) fungiert als Negativkontrolle, was darauf hindeutet, dass die H2O2-induzierte Akkumulation von DNMTs an Chromatin zumindest teilweise durch CHD4 vermittelt wurde. Darüber hinaus konnten wir endogene CHD4-, γH2a.X- und erhöhte 5mC-Signale an den Schadensstellen 60 Minuten nach laserinduzierten DNA-Schäden nachweisen, die nach dem Abbau von CHD4 drastisch reduziert wurden (Abb. 1i), was darauf hindeutet, dass CHD4 eine zentrale Rolle spielt bei der durch DNA-Schäden vermittelten DNA-Methylierung während des Reparaturprozesses. Als nächstes verglichen wir die Expression von Elovl2 in menschlichen Fibroblastenzellen vor und nach der H2O2-Behandlung mittels qPCR. Die Expression von Elovl2 war nach der H2O2-Behandlung in Gruppen mit individuellem DNMT-Knockdown signifikant verringert, jedoch nicht mit CHD4-Knockdown (ergänzende Abbildung 1h), was darauf hinweist, dass der individuelle Knockdown eines einzelnen DNMT die H2O2-induzierte Elovl2-Stummschaltung nicht blockieren würde, da andere epigenetische Modifikatoren dies mögen G9a, das H3K9me3 etabliert, kann auch von CDH4 rekrutiert werden.25 Andererseits rettete der Abbau von CHD4 das Expressionsniveau von Elovl2 nach der H2O2-Behandlung dramatisch, was auf eine zentrale Rolle bei der Vermittlung der DNA-Methylierung und der weiteren Herunterregulierung der Transkriptionsaktivität von Elovl2 hinweist. Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass die altersbedingte DNA-Methylierung durch den NuRD-Komplex bei DNA-Schäden vermittelt werden kann.

Derzeit ist für ELOVL2 keine komplexe Struktur in der PDB-Datenbank verfügbar. Es gibt sieben Mitglieder der ELOVL-Familie, in denen die Struktur von ELOVL7 aufgeklärt wurde.25 Um mögliche gemeinsame Strukturmerkmale von ELOVL-Proteinen zu identifizieren und umfassende Einblicke in ihre Funktionen zu gewinnen, haben wir eine KI-basierte Methode zur Vorhersage verwendet 3D-Proteinstrukturen dieser Proteine und ihrer Komplexe mit PUFA-Substraten. Die von unserem KI-Modell KeystoneFold vorhergesagte Struktur jedes ELOVL-Proteins war der von RoseTTAFold und AlphaFold2 vorhergesagten Struktur sehr ähnlich (Abb. 2a). Unsere Vorhersagen zeigten auch, dass die sieben ELOVL-Proteine sehr ähnliche Strukturen (Abb. 2b) als sieben Transmembrandomänen annahmen, die eine katalytische Kerntasche bilden. Um den Teil der Domäne zu identifizieren, der für die Substratbindung verantwortlich ist, haben wir molekulardynamische Modelle angewendet, um mögliche Docking-Wechselwirkungen von PUFAs mit ELOVL2 zu bewerten und zu vergleichen (Abb. 2c). Unser KI-Modell sagte eine günstige Wechselwirkung zwischen dem zentralen Tunnel des aktiven Zentrums von ELOVL2 und PUFAs voraus.

Vorhergesagte Strukturen von ELOVLs. a Ausrichtung der Strukturen von ELOVL2, vorhergesagt von KeystoneFold, RoseTTAFold und AlphaFold2. Alle Strukturen werden als Cartoons dargestellt und entsprechend den verwendeten Algorithmen eingefärbt. Der Hauptstrukturunterschied liegt im C-Terminus. b Die von KeystoneFold vorhergesagten Strukturen von ELOVL1-7. Alle Strukturen werden als Cartoons dargestellt. c Der Bindungsmodus von Lipidsubstraten PUFAs wird durch molekulares Andocken vorhergesagt (dargestellt als blaue und orangefarbene Stäbchen).

Frühere Studien zum Verlust der Elovl2-Funktion beschränkten sich hauptsächlich auf die Fortpflanzungsentwicklung von Mäusen und den Lipidstoffwechsel,19,26 altersbedingte Phänotypen wurden jedoch nicht vollständig untersucht. Um die Funktion von Elovl2 im Alterungsprozess zu untersuchen, haben wir Elovl2-Knockout-Mäuse mit der CRISPR-Cas9-Technologie generiert (ergänzende Abbildung 2a). Insgesamt haben wir 40 Elovl2+/−- und 84 Elovl2−/−-Gründermäuse erzeugt. Bei Elovl2−/− Mäusen trugen 32 Mäuse eine 59 bp lange Deletion im 3. Exon, die ein Stoppcodon erzeugte. Western Blot zeigte, dass Elovl2 in Elovl2 −/− Mäusen vollständig abgereichert war (ergänzende Abbildung 2b). Unsere Experimente wurden an diesen 59-bp-Deletionsmäusen durchgeführt, da sowohl Elovl2+/−- als auch Elovl2−/−-Mäuse unabhängig von Geschlecht oder Stamm unfruchtbar waren; Dies stimmte nicht mit dem vorherigen Bericht überein.19 Dies kann durch unterschiedliche Knockout-Erkrankungen und Nahrungsergänzungsmethoden verursacht werden. In unserer Studie wurde für die Welpen oder erwachsenen Mäuse eine strenge Nicht-PUFA-Milch und eine zutatendefinierte Nicht-PUFA-Diät verwendet, um den Verzehr von PUFAs aus der Nahrungsaufnahme zu verhindern. Anschließend untersuchten wir die wichtigsten Alterungsparameter nach 8 Monaten Wachstum. Elovl2 −/− junge Mäuse (−/− Y) zeigten eine Reihe alterungsbeschleunigter Phänotypen, darunter Haarausfall (Abb. 3a), Verringerung der Knochendichte (Abb. 3b und ergänzende Abb. 2c), Ausdauer (ergänzende Abb. 2d) und Muskelkraft (ergänzende Abb. 2e). Darüber hinaus zeigte der Freiland-Verhaltenstest, dass −/− Y-Mäuse ein verringertes Erkundungsverhalten und eine erhöhte Angst zeigten, die dem Verhalten alter Wildtyp-Mäuse (WT-O, 20 Monate alt) ähnelten (Abb. 3c). . Darüber hinaus deutete der Morris-Wasserlabyrinthtest auf einen signifikanten Rückgang der Lern- und Merkfähigkeit bei −/− Y-Mäusen hin (ergänzende Abbildung 2f). Darüber hinaus weisen die Elovl2-/−-Mäuse über die gesamte Lebensdauer eine viel kürzere Lebenserwartung auf als Wildtyp-Mäuse und weisen sowohl im 129/sv- als auch im ICR-Hintergrund eine viel frühere Todesrate im Alter von 10 Monaten auf. Dies deutete darauf hin, dass ein Elovl2-Mangel zu einer schwerwiegenden Verkürzung der Lebensdauer von Elovl2-/-Mäusen führen könnte. Alterungsbedingte histopathologische Phänotypen wurden auch bei −/− Y- und WT-O-Mäusen auf lokaler gewebephysiologischer Ebene nachgewiesen (Abb. 3e und ergänzende Abb. 2g, h). Diese Ergebnisse zeigten, dass der Mangel an Elovl2 bei Mäusen in mehrfacher Hinsicht zu einem bemerkenswerten Phänotyp der Beschleunigung des Alterns führte.

Die Löschung von Elovl2 führte bei Mäusen zu stark beschleunigten Alterungsphänotypen und Stoffwechselstörungen. a Haarausfall bei jungen (8 Monate) Elovl2-Knockout-Mäusen (−/− Y), aber nicht bei Wildtyp-Mäusen (WT-Y) 129/sv. b Mikrocomputertomographie (Mikro-CT) zur Darstellung des Knochenvolumens/Gesamtvolumens (BV/TV) und der Trabekeldicke (Tb. Th.) im Femur von Mäusen (n = 3 pro Gruppe). Die WT-O-Mäuse sind 20 Monate alt und werden in unserer Tierhaltung mit normaler Ernährung und Lebensbedingungen gehalten. Fehlerbalken, REM. Die Signifikanzniveaus wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test berechnet. c Ergebnisse von Freilandtests in verschiedenen Gruppen von 129/sv-Mäusen (n = 20 pro Gruppe). Fehlerbalken, REM. Die Signifikanzniveaus wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test berechnet. d Überlebenskurve von Wildtyp-129/sv- und ICR-gegen-Elovl2-Knockout-Mäusen (WT n = 26, −/− n = 25 in 129/sv; WT n = 25, −/− n = 24 in der ICR-Gruppe). e Hämatoxylin- und Eosin-Färbung und pathologische Schnittanalyse von Lebergewebe. Grüne Zyklen zeigen die abnormalen Strukturen. Maßstabsbalken, 100 µm. Für jede Gruppe wurden 40 Schnitte von fünf Mäusen zur statistischen Analyse entnommen. Die Signifikanzniveaus wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test berechnet. f Wärmekarte der Fettsäurespezies in Leber, Gehirn und Plasma von 129/sv-Mäusen (n = 8 pro Gruppe, es wird eine fache Änderung im Log2-Maßstab verwendet). g Oil Red O (ORO)-Färbung der Leber. Fehlerbalken, REM. Maßstabsbalken, 100 µm. Für jede Gruppe wurden 40 Schnitte von fünf Mäusen zur statistischen Analyse entnommen. Die Signifikanzniveaus wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test berechnet. h Ultraschalltestergebnisse (n = 20 pro Gruppe). Fehlerbalken, REM. Die Signifikanzniveaus wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test berechnet. i Ergebnisse des Glukosetoleranztests (GTT) und des Insulintoleranztests (ITT) (n = 12 pro Gruppe). Fehlerbalken, REM. Die Signifikanzniveaus wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test berechnet

Als nächstes untersuchten wir, ob ein Elovl2-Mangel den Alterungsprozess durch Stoffwechselstörungen beschleunigen kann. In Anbetracht der Tatsache, dass Elovl2 eine entscheidende Rolle im Lipidstoffwechsel spielt, indem es als Elongase für langkettige Fettsäuren von 20: C bis 28: C19 fungiert (ergänzende Abbildung 3a), führten wir eine Lipidomanalyse durch. Es gab eine dramatische Anreicherung von Fettsäuren mit weniger als 20 Kohlenstoffatomen und einen Trend zum Mangel an PUFAs im Plasma sowohl von WT-O- als auch von −/−Y-Mäusen. Die Anreicherung kurzkettiger Fettsäuren war sowohl bei WT-o als auch bei −/−Y von ICR offensichtlicher, jedoch nicht im Stamm 129, was darauf hindeutet, dass möglicherweise ein genetischer Effekt vorliegt. In der gesamten Leber, im Gehirn und im Plasma von −/−Y wurde ein signifikanter Rückgang an PUFAs wie DHA festgestellt, jedoch verblieb immer noch eine relativ geringe Menge an DHA im WT-O. (Abb. 3f und ergänzende Abb. 3b). Wir stellten fest, dass die Gesamtfettsäurezusammensetzung von −/− Y-Mäusen abnormaler war als die der WT-O-Mäuse, was auf die verbleibende ELOVL2-Funktion bei alten Mäusen hinweist. Obwohl wir keine Adrensäure nachweisen konnten, wird berichtet, dass ELOVL2-Knockout auch den Adrensäuregehalt erhöht.27 Mithilfe der Ölrot-O-Färbung beobachteten wir eine erhebliche Anreicherung von Fettsäuren in Hepatozyten sowohl bei WT-O- als auch bei −/− Y-Mäusen ( Abb. 3g). Darüber hinaus wurde mittels Ultraschall bei WT-O- und −/− Y-Mäusen ein Steatohepatitis-Phänotyp festgestellt (Abb. 3h). In der klinischen Praxis könnten diese Veränderungen eine Lebersteatose verursachen, gefolgt von Lipotoxizität28 und Insulinresistenz.29,30 Vor diesem Hintergrund führten wir einen Glukosetoleranztest und einen Insulintoleranztest durch. Wir beobachteten dramatische Glukosetoleranz- und Insulinresistenz-Phänotypen bei den −/− Y-Mäusen (Abb. 3i und ergänzende Abb. 3c). Dieses Ergebnis stimmte mit einer früheren Studie überein, in der berichtet wurde, dass die Transkriptionsaktivität von Elovl2 in engem Zusammenhang mit der Insulinsekretion steht.16 Zusammengenommen deuteten diese Ergebnisse auf eine schwere Stoffwechselstörung bei Mäusen mit Elovl2-Mangel hin.

Da wir wussten, dass ein Mangel an Elovl2 die Synthese von PUFAs beeinträchtigen würde, untersuchten wir als Nächstes, ob die Nahrungsergänzung mit PUFAs den Phänotyp des beschleunigten Alterns vollständig retten könnte. Im Vergleich zur Kontrollgruppe verbesserte die Nahrungsergänzung mit PUFAs (Fischöl) die Fettsäureansammlung in der Leber von −/− Y-Mäusen leicht und verbesserte das physiologische Glukosestoffwechselgleichgewicht, reichte jedoch nicht für eine vollständige Genesung aus (Abb. 3g, h und Ergänzung). Abb. 3c). Ein Verhaltenstest im Freiland zeigte, dass eine Nahrungsergänzung mit PUFAs zu einer leichten Verbesserung des Alterungsphänotyps führte (ergänzende Abbildung 3d). Darüber hinaus linderte die Nahrungsergänzung mit PUFAs altersbedingte histopathologische Phänotypen nicht (ergänzende Abbildung 3e). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Beitrag des Mangels an Elovl2 zum Altern nicht ausschließlich auf einen Mangel an Nährstoff-PUFAs zurückzuführen ist.

Adulte Stammzellen sind für die Aufrechterhaltung der Gewebefunktion und Homöostase unerlässlich. Es wurde gezeigt, dass der Stoffwechsel eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung eines adulten Stammzellpools spielt.31 Kürzlich berichtete Oishi, dass der Lipidstoffwechsel, insbesondere die PUFA-Synthese, eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort spielt.32 PUFAs wie DHA und Eicosapentaensäure usw Vorläufer von Entzündungshemmern können Entzündungen regulieren.33,34 Vor diesem Hintergrund stellten wir die Hypothese auf, dass −/− Y-Mäuse stark chronische Entzündungen hervorrufen könnten.

Tatsächlich zeigte die Analyse von Blutproben einen signifikanten Anstieg der Entzündungsfaktoren sowohl bei −/− Y- als auch bei WT-O-Mäusen (Abb. 4a und ergänzende Abb. 4a). Wir untersuchten auch den Entzündungsstatus in der Leber und stellten fest, dass die MCP1- und TNF-α-Spiegel bei WT-O- und −/− Y-Mäusen dramatisch erhöht waren (Abb. 4b). Es ist bekannt, dass chronische Entzündungen zu Gewebefibrose und der Erschöpfung endogener Stamm-/Vorläuferzellreservoirs führen.33,34 Im Einklang mit diesen Erwartungen beobachteten wir eine Zunahme der Fibrose in der Leber (Abb. 4c). Darüber hinaus wurde ein signifikanter Verlust der Stammzellpopulation in Haarfollikeln (CK15) und im Darm (LGR5) festgestellt (Abb. 4d).

Die Erschöpfung von Elovl2 führte zu chronischer Entzündung, Zellalterung und Erschöpfung adulter Stammzellen. a Konzentration der Entzündungsfaktoren im Blut, gemessen durch ELISA (n = 6 pro Gruppe). Fehlerbalken, REM. Die Signifikanzniveaus wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test berechnet. b Western Blot von TNF-α und MCP-1 (n = 3). c Masson-Trichrom-Färbung auf der Leber. Fehlerbalken, REM. Maßstabsbalken, 100 µm. Für jede Gruppe wurden 40 Schnitte von fünf Mäusen zur statistischen Analyse entnommen. Die Signifikanzniveaus wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test berechnet. d Mit den epithelialen Vorläuferzellmarkern gefärbte Haarfollikel und Därme. Maßstabsbalken, 100 µm. Fehlerbalken, REM. Für jede Gruppe wurden 40 Schnitte von fünf Mäusen zur statistischen Analyse entnommen. Die Signifikanzniveaus wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test berechnet

Als nächstes untersuchten wir die Struktur der Großhirnrinde und des Hippocampus mittels Magnetresonanztomographie, was eine dramatische Abnormalität bei −/− Y- und WT-O-Mäusen ergab (ergänzende Abbildung 4b). Die RNA-Seq-Analyse zeigte auch ein bemerkenswert abnormales Expressionsprofil und ein beeinträchtigtes funktionelles Genexpressionsmuster im Gehirn von −/− Y-Mäusen (ergänzende Abb. 4d, e). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Versäumnis, endogene oder extrinsische Entzündungsreize in Geweben mit einem Mangel an Elovl2 aufzulösen, zu chronischen Entzündungen, einer Erschöpfung der Stammzellen und einem Verlust der Gewebefunktion führte, was wiederum zu Alterungsphänotypen führte.

Um den molekularen Mechanismus zu identifizieren, der für den Verlust von Elovl2 im Alter verantwortlich ist, führten wir eine RNA-Seq an Leber- und Gehirnproben von WT-Y- und −/− Y-Mäusen durch. Im Vergleich zur Hochregulierung von Genen in alten Mäusen, über die in früheren Studien35 berichtet wurde, waren diese Gene auch in unseren −/− Y-Mäusen angereichert (Abb. 5a); Die herunterregulierten Gene zeigten ein konsistentes Muster (Abb. 5a). Interessanterweise stellten wir fest, dass −/− Y-Mäuse ein ähnliches Expressionsprofil aufwiesen wie Mäuse mit einer fettreichen Diät, was bestätigte, dass die Elovl2-Ablation zu einer Fettsäureakkumulation führte (ergänzende Abbildung 5a). Als nächstes identifizierten wir 1867 unterschiedlich exprimierte Gene (p-Wert <0, 05) in der Leber von −/− Y-Mäusen im Vergleich zu denen von WT-Y-Mäusen, wobei 1084 Gene hochreguliert und 783 Gene herunterreguliert waren. Die GO-Anreicherungsanalyse zeigte, dass der Fettsäure-/Lipidstoffwechsel, die zellulären Reaktionen auf den Insulinreiz, die Mitochondrienfunktion und die ungekoppelte Proteinreaktion falsch reguliert waren (Abb. 5b). Bemerkenswerterweise stellten wir fest, dass die ER-Stress-assoziierten Gene hochreguliert waren (Abb. 5c und ergänzende Abb. 5b), was mit einer früheren Studie übereinstimmt, in der berichtet wurde, dass Lipotoxizität zu ER-Stress führen könnte.29,30 Es ist bekannt, dass beide Lipotoxizität und ER-Stress kann die Mitochondrienfunktion beeinträchtigen. Tatsächlich fanden wir heraus, dass mitochondriale funktionsassoziierte Gene, wie etwa diejenigen, die am Fettsäure-β-Oxidationsprozess und am Insulinrezeptor-Signalweg beteiligt sind, herunterreguliert waren, während mitochondriale entkoppelte Proteinantwort (UPRmt) und Glykolyse-assoziierte Gene hochreguliert waren (Abb. 5c). In Übereinstimmung mit den RNA-Seq-Daten zeigte qPCR auch die gleichen Expressionsmuster (ergänzende Abbildung 5c). Darüber hinaus haben wir die unterschiedlich exprimierten Überlappungsgene sowohl im Gehirn als auch in der Leber analysiert und festgestellt, dass 121 Überlappungsgene herunterreguliert und 304 Überlappungsgene hochreguliert sind. Unter diesen hochregulierten Überlappungsgenen wurde oben aus der genonkologischen Analyse die DNA-Reparatur-Zellreaktion auf einen DNA-Schadensstimulus dargestellt (ergänzende Abbildung 5g). Dies deutete auf einen gemeinsamen Alterungs-/Seneszenzstatus sowohl im Gehirn- als auch im Lebergewebe bei ELOVL2-Knockout-Mäusen hin.

Ein Elovl2-Mangel führte zu Stress im endoplasmatischen Retikulum und mitochondrialer Dysfunktion. a Angereicherte Gensätze unterschiedlich exprimierter Gene in −/− Y-Proben. Die horizontale Achse stellt die unterschiedlich exprimierten Gene in −/− Y im Vergleich zu WT-O-Proben dar, die in −/− Y entweder als hoch- oder herunterreguliert eingestuft und rot bzw. blau markiert wurden. Der normalisierte Anreicherungsscore (NES) und die Falscherkennungsrate (FDR) sind markiert. b Die Genontologie-Begriffe sind bei −/− Y-Mäusen im Vergleich zu WT-Y-Mäusen an hoch- oder herunterregulierten Genen angereichert. Die tatsächlichen p-Werte sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt −/− Y). d HSPA5-Färbung in der Leber. Fehlerbalken, REM. Für jede Gruppe wurden 40 Schnitte von fünf Mäusen zur statistischen Analyse entnommen. Die Signifikanzniveaus wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test berechnet. e Western Blot für die Marker von ER-Stress (n = 3). f Der Seahorse XF Mitochondrien-Stresstest (n = 4). Fehlerbalken, REM. Die Signifikanzniveaus wurden mit dem einseitigen Student-t-Test berechnet. g Der Seahorse XF-Glykolysetest (n = 4). Fehlerbalken, REM. Die Signifikanzniveaus wurden mit dem einseitigen Student-t-Test berechnet

Mitochondrien sind auf vielfältige Weise am Alterungsprozess beteiligt, beispielsweise bei der Energieproduktion, der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und UPRmt. Außerdem tragen Mitochondrien zu den Veränderungen bei, die im zellulären Seneszenzzustand verursacht werden.37,38,39,40 Basierend auf unserer RNA-seq-Datenanalyse und Hinweisen aus früheren Berichten haben wir daher die Hypothese aufgestellt, dass ein Mangel an Elovl2 das Altern fördert und ER-Stress und Mitochondrien verursacht Funktionsstörung.

Um unsere Hypothese zu überprüfen, haben wir den ER-Stresspegel und die Mitochondrienfunktion im Lebergewebe gemessen. ER-Stressmarker wie HSPA5, phosphoryliertes EIF2α (p-EIF2α), p-ERN1 und ATF6 wurden in WT-O- und −/− Y-Mäusen hochreguliert (Abb. 5d, e). Anschließend verwendeten wir den Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test, um Schlüsselparameter der Mitochondrienfunktion zu untersuchen, indem wir die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) primärer Hepatozyten von WT-O- und −/− Y-Mäusen direkt maßen. Für die Basalatmung stellten wir fest, dass die OCR bei −/− Y-Mäusen signifikant erhöht war (Abb. 5f, 1), was durch die Oligomycin-Behandlung nicht verringert wurde, was auf eine erhöhte Inzidenz entkoppelter Atmung hindeutet (Abb. 5f, 2). Dies weist darauf hin, dass bei −/− Y-Mäusen eine durch Hypoxie verursachte mitochondriale Dysfunktion vorliegt, die auch auf überflüssige Fettsäuren zurückzuführen sein kann.41,42

Vorhersehbarerweise kam es nach der Zugabe von FCCP zu einem geringeren Niveau der mitochondrialen Maximalatmung bei −/− Y-Mäusen (Abb. 5f, 3). Darüber hinaus stellten wir fest, dass −/− Y-Mäuse eine erhöhte glykolytische Aktivität zeigten (Abb. 5g). Sowohl bei Krebszellen als auch bei seneszenten Zellen wurde eine Umstellung des Stoffwechsels von oxidativer Phosphorylierung auf Glykolyse, bekannt als Warburg-Effekt, beobachtet. Es wurde auch in unseren RNA-seq-Daten identifiziert (Abb. 5c).

Eine der Folgen von chronischem ER-Stress und mitochondrialer Dysfunktion ist oxidativer Schaden auf zellulärer Ebene. Mithilfe verschiedener Nachweismethoden stellten wir fest, dass sich oxidative Schäden sowohl in Mitochondrien (ergänzende Abbildung 5d, MitoSOX für mitochondriales Superoxid) als auch in Kernen (ergänzende Abbildung 5d, γ-H2AX für oxidative DNA-Schäden) entwickelten und sich auf Proteine auswirkten (ergänzende Abbildung 5e). , AOPP), Lipide (Ergänzende Abb. 5e, MDA) und RNA (Ergänzende Abb. 5e, 8-OHG). Wie erwartet waren antioxidative Enzyme überaktiviert (Ergänzende Abbildung 5e, GSH-PX, CAT, T-SOD und TAC). Bemerkenswerterweise wurden bei solch schweren oxidativen Schäden höhere zelluläre Seneszenzmarker bei −/− Y- und WT-O-Mäusen festgestellt (ergänzende Abbildung 5f).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Fehlen von Elovl2 zur Akkumulation kurzkettiger Fettsäuren, ER-Stress und mitochondrialer Dysfunktion auf zellulärer Ebene führen könnte.

Unsere bisherigen Ergebnisse zeigten, dass der Abbau von Elovl2 bei Mäusen zu einem degenerativen Phänotyp des Zentralnervensystems führte. Wir gehen davon aus, dass ein möglicher degenerativer Effekt auch im Sehnervensystem durch einen ELOVL2-Mangel hervorgerufen werden könnte. Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine Augenerkrankung, die zu einer Beeinträchtigung des zentralen Sehvermögens führen kann. Dies geschieht, wenn durch Alterung die Makula geschädigt wird. In unserer vorherigen Studie haben wir AMD-ähnliche Phänotypen in den Augen von Elovl2-Knockout-Mäusen gefunden, die einen Anstieg des Zellseneszenzsignals in verschiedenen Schichten der Netzhaut und einen Verlust der Sehfunktion zeigen (Daten nicht gezeigt). Diese Phänotypen stehen im Einklang mit einer kürzlich veröffentlichten Arbeit von Chen et al. Dabei wurde der AMD-Phänotyp durch Drusen und andere Marker in mutierten Elovl2-Mäusen bestätigt.43 Vor diesem Hintergrund untersuchten wir als nächstes, ob die Elovl2-Ablation zu einem AMD-Phänotyp in menschlichen Zellen führen könnte. Wir haben Elovl2-Knockdown-RPE-Zelllinien (KE) über die Lentivirus-Abgabe von shRNAs an menschliche primäre RPE-Zellen (generiert von gesunden Spendern) entwickelt (ergänzende Abbildung 6a, b). Wie erwartet führte der Abbau von Elovl2 zu zellulärer Seneszenz (Abb. 6a) und einer beeinträchtigten Proliferation (Abb. 6b).37 Wir konnten auch die Hochregulierung von SASP-Markern, einschließlich P53, P21, IL-1b und IL-639, in KE-Zellen feststellen (Abb. 6c). Es wurde festgestellt, dass in KE-Zellen zahlreiche Seneszenz- und AMD-Marker sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene erhöht sind (Abb. 6c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass durch den Mangel an Elovl2 in menschlichen RPE-Zellen ein AMD-Modell mit einem erhöhten SASP-Phänotyp erzeugt werden kann.

AMD-Phänotyp, induziert durch die Abreicherung von Elovl2 in menschlichen RPE-Zellen. eine β-Galactosidase-Färbung auf menschlichen RPE-Zellen ohne Behandlung (Kontrolle) oder Elovl2-Knockdown (Elovl2 KD) (n = 3). Maßstabsbalken, 100 µm. b Analyse der Zellverdopplungszeit (n = 9). Fehlerbalken, REM. *p < 0,05. Die Signifikanzniveaus wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test berechnet. Western Blot (c) und qPCR (d) von Seneszenz- und AMD-Markern in Leer- und KE-Zellen (n = 3). *p < 0,05. Die Signifikanzniveaus wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test berechnet. e Das Expressionsmuster von Genen in Signalwegen im Zusammenhang mit ER-Stress und zellulärer Seneszenz (n = 2). f Die Begriffe der Genontologie sind mit hochregulierten Genen in KE-RPE-Zellen angereichert. g MitoSOX-Färbungsergebnisse (n = 3). Maßstabsbalken, 100 µm. h Immunfluoreszenz von Blind- und KE-RPE-Zellen, behandelt mit Nicotinamid (Ni) mit VEGF- und Aβ-Antikörpern (n = 3). Maßstabsbalken, 100 µm

Wie oben erwähnt, führte der Mangel an Elovl2 zur Ansammlung von Fettsäuren, was chronischen ER-Stress und mitochondriale Dysfunktion auslöste. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass diese Beeinträchtigungen auch im durch Elovl2-Mangel induzierten menschlichen AMD-Modell auftreten. Tatsächlich stellten wir anhand der RNA-seq-Analyse einen dramatischen Anstieg des chronischen ER-Stresses und der zellulären Seneszenz in KE-Zellen fest (Abb. 6e und ergänzende Abb. 6c). Darüber hinaus zeigte die GO-Term-Analyse eine mitochondriale Dysfunktion in KE-Zellen; Gene, die mit der Mitochondrienfunktion assoziiert sind, beispielsweise diejenigen, die den NAD-Biosyntheseprozess und apoptotische mitochondriale Veränderungen steuern, waren fehlreguliert (Abb. 6f und ergänzende Abb. 6d). Darüber hinaus stellten wir die Anhäufung oxidativer Schäden in den Mitochondrien fest (Abb. 6g), was auf schwere oxidative Schäden in KE-Zellen zurückzuführen ist. Sowohl im Maus- als auch im menschlichen Zellmodell führte der Elovl2-Mangel zu einem Anstieg der oxidativen Schäden, die durch chronischen ER-Stress und mitochondriale Dysfunktion verursacht wurden.

Mitochondriale Anomalien sind ein früher Auslöser neuronaler Dysfunktionen. Es wurde berichtet, dass die Wiederherstellung der Mitochondrienfunktion durch den NAD+-Vorläufer Nikotinamid (Vitamin B3) sowohl prophylaktisch als auch als Intervention gegen Glaukom, eine neurodegenerative Erkrankung, die insbesondere bei älteren Menschen zu Sehverlust führt, schützend wirkte.40 Um weiter zu bestätigen, ob die Wiederherstellung der Mitochondrien retten kann AMD-Phänotyp in Elovl2-Knockdown-RPE-Zellen behandeln wir die Elovl2-Knockdown-RPE-Zellen mit Nicotinamid (Ni). Interessanterweise kehrte die Behandlung mit Ni während der Kultivierung von KE-Zellen die abnormale Expression zellulärer Seneszenzgene dramatisch um und verringerte die mitochondriale Dysfunktion, was zu einer bemerkenswerten Reduzierung der AMD-Marker führte (Abb. 6h). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Wiederherstellung der Mitochondrienfunktion den durch die Elovl2-Depletion verursachten AMD-Phänotyp verbessern kann.

Epigenetische Veränderungen sind eines der Kennzeichen des Alterns. Der integrale Zusammenhang zwischen Alterung und DNA-Methylierungsgrad wurde Ende der 1960er Jahre festgestellt; allerdings wurde erst vor kurzem die Korrelation zwischen der DNA-Methylierung an mehreren hundert CpG-Stellen und dem biologischen Alter genau festgestellt.6,11 Wir und andere haben gezeigt, dass die DNA-Methylierung spezifischer Genorte als genauer Biomarker des biologischen Alterns verwendet werden kann Menschen und Mäuse.4,11,15,16 Die funktionellen Konsequenzen der DNA-Methylierung an diesen CpG-Stellen sind Gegenstand vieler Diskussionen und Spekulationen. In unserem vorherigen Bericht haben wir eine Reihe von Alterungsmarkern identifiziert; Einige dieser Markergene sind am Fettstoffwechsel beteiligt. Interessanterweise zeigt Elovl2, ein Gen, das als Hauptkontrolle des Lipidstoffwechsels fungiert und stark mit Diabetes assoziiert ist, die größte Relevanz für das Altern.4,11,15,16 Slieker et al. behaupteten, dass ELOVL2 ein einzigartiger, gewebeunabhängiger, altersassoziierter DNA-Methylierungsmarker sei,15 ein späterer Bericht zeigte jedoch, dass ELOVL2 kein einzigartiger universeller Alterungsmarker ist und dass es viel mehr CpG-Stellen/Gene gibt, die sich mit dem Alter über viele hinweg konsistent verändern verschiedene Zell-/Gewebetypen. Einige von ihnen sind auf Gene in Wnt- und Glutamatrezeptor-Signalwegen abgebildet und verändern sich mit zunehmendem Alter in mindestens zehn verschiedenen Zell-/Gewebetypen.17 Diese faszinierende Beobachtung weist auch auf eine potenziell wichtige Rolle des Wnt-Wegs beim Altern hin, da der Wnt-Weg maßgeblich zur Aufrechterhaltung beiträgt adulter Stammzellpool während des Alterns. Weitere Studien müssen in diesem aufstrebenden Bereich durchgeführt werden.

Der Mechanismus, wie die altersbedingte DNA-Methylierung vermittelt wird, bleibt unklar. Zellschäden spielen eine Schlüsselrolle bei der Auslösung der epigenetischen Gen-Stummschaltung.3,22,23 Die Transkriptionsrepressoren können sofort rekrutiert werden, um die Transkription an der Stelle zum Schweigen zu bringen, kurz nachdem DNA-Schäden aufgetreten sind.24 Chromatin-Stummschaltung ist erforderlich, um den Schadensreparaturprozess sicherzustellen. Unterdessen blieb die nachfolgende abnormale DNA-Methylierung nach diesem Prozess erhalten. Hier haben wir gezeigt, dass der NuRD-Komplex eine Schlüsselrolle bei der Vermittlung der DNA-Methylierung an diesen altersbedingten Stellen während zellulärer oxidativer Schäden oder nach DNA-Doppel-/Einzelstrangbrüchen spielt. Es bedarf jedoch noch weiterer Studien, um den Mechanismus der durch zufällige DNA-Schäden verursachten DNA-Methylierung zu verstehen.

Elovl2, ein wichtiger Alterungsmarker, spielt eine entscheidende Rolle bei der Verlängerung sehr langkettiger Fettsäuren. Frühere Studien zeigen durch genomweite Assoziationsstudien in Mausmodellen, dass Elovl2 auch mit Diabetes assoziiert ist.16 Dies stützt die Annahme, dass Elovl2 eine entscheidende Verbindung zwischen Stoffwechsel und Alterung darstellt. Hier untersuchten wir zunächst in einem gentechnisch veränderten Mausmodell, ob Elovl2 eine funktionelle Rolle beim Altern spielt. Obwohl sich die Lebenserwartung von Mensch und Maus stark unterscheidet (insbesondere die maximale Lebenserwartung unterscheidet sich dramatisch), ist die Form der theoretischen Lebenserwartungskurven, die oft als repräsentativ für die Gesundheit des Organismus angesehen werden, bei allen Arten bemerkenswert konsistent.44 Mehrere Übersichtsarbeiten haben dies sehr gut gezeigt Da der konservierte Phänotyp und der Mechanismus des Alterns sowohl beim Menschen als auch bei der Maus vorhanden sind, sind einige davon sogar bei allen Arten, einschließlich Hefe, Würmern und Fliegen, bemerkenswert konsistent. Tatsächlich haben Lopez-Otin et al. haben diese konservierten Merkmale des Alterns in eine Reihe von 9 „Markenzeichen des Alterns“ kategorisiert,45 von denen sich viele über die evolutionäre Distanz von der Hefe bis zum Menschen erstrecken. Die 9 identifizierten Merkmale des Alterns sind wie folgt: genomische Instabilität, mitochondriale Dysfunktion, deregulierte Nährstoffwahrnehmung, Verlust der Proteostase, epigenetische Veränderungen, zelluläre Seneszenz, Erschöpfung der Stammzellen, veränderte intrazelluläre Kommunikation und Telomerabrieb. Es ist sehr wertvoll, diesen Vorteil zu nutzen, um den Alterungsmechanismus in Tiermodellen zu untersuchen und den Menschen zu erreichen. In dieser Studie haben wir CRISPR-Cas9 verwendet, um Elovl2-Knockout-Mäuse zu erzeugen. Im Gegensatz zum vorherigen Bericht fanden wir in unserer Studie einen dramatischen Phänotyp der Alterungsbeschleunigung und viele Merkmale von neun Merkmalen des Alterns bei den Elovl2-Knockout-Mäusen, was auf deren entscheidende Rolle im Alterungsprozess schließen lässt. Darüber hinaus ist die Struktur von Elovl2 und anderen Familienmitgliedern noch nicht vollständig geklärt. Mit der rasanten Weiterentwicklung der KI-Anwendung in der Strukturbiologie haben wir unser KeystoneFold-Modell zusammen mit RoseTTAFold und der AlphaFold2-Methode verwendet, um die Struktur von ELOVL2 vorherzusagen. Die erfolgreiche Beschreibung der Proteinstruktur von ELOVL2 und anderen ELOVL-Familien könnte uns helfen, den Lipidsyntheseprozess aus einer anderen Perspektive besser zu verstehen.

Die Lipidsynthese basiert auf der normalen Funktion von ER, dem Standort von Elovl2. Neben der Lipidsynthese erfüllt das ER auch wichtige Funktionen im Zusammenhang mit der Synthese, Faltung und dem Transport von Proteinen. Es wurde bereits früher berichtet, dass die Ansammlung freier Fettsäuren im ER die ER-Funktion schädigen würde, was zu einem erhöhten Auftreten ungefalteter oder fehlgefalteter Proteinbelastung und chronischem ER-Stress führen würde. Eine Verringerung der PUFA-Synthese nach der Elovl2-Ablation führt zu einem kompensatorischen Anstieg der Fettsäuresynthese, der die zelluläre Stoffwechselhomöostase durch die Akkumulation von Fettsäurevorläufern für PUFAs im ER und Veränderungen im mitochondrialen Energiestoffwechsel beeinflussen kann. ER-Stress hängt auch mit Insulinresistenz und mitochondrialer Dysfunktion zusammen (ergänzende Abbildung 7).

Mitochondrien sind die Kraftwerke der Zelle und spielen eine herausragende Rolle bei der Energieerzeugung durch Atmung und der Regulierung des Zellstoffwechsels.38,39 Ein Elovl2-Mangel führte zu einer Umstellung des Stoffwechsels vom Tricarbonsäurezyklus auf die Glykolyse, ein Effekt, der reaktivere oxidative Spezies produziert (ROS) verursacht oxidativen Stress in Zellen, Geweben und Organen und fungiert auch als Bote für Entzündungsreaktionen. Darüber hinaus sind PUFAs für die Lösung von Entzündungen unerlässlich. Darüber hinaus kam es beim Elovl2-Knockout zu einer dramatischen Anreicherung von Fettsäuren, einschließlich Arachidonsäure. Da die Akkumulation von Arachidonsäure aufgrund ihrer Verwendung zur PGE2-Erzeugung auch zur Entzündung beitragen könnte, könnte PGE2 an der Entzündung beim Elovl2-Knockout beteiligt sein. Wir würden es in Zukunft studieren. Im Zusammenhang mit dem Elovl2-Knockout kam es in einer Reihe von Geweben zu einem deutlichen Anstieg der physiologischen Entzündung, der zellulären Seneszenz und der Erschöpfung adulter Stammzellen (ergänzende Abbildung 7). Im Einklang mit der Annahme, dass diese physiologischen Veränderungen zum Alterungsphänotyp beitragen, fanden wir im Auge von Elovl2-Knockout-Mäusen einen AMD-ähnlichen Phänotyp, der durch einen Anstieg des Zellseneszenzsignals in verschiedenen Schichten der Netzhaut, eine Zerstörung der RPE-Schicht46 und einen Verlust der Sehfunktion angezeigt wird. Diese Phänotypen stehen im Einklang mit einer kürzlich veröffentlichten Arbeit von Chen et al. Dabei wurde der AMD-Phänotyp durch Drusen und andere Marker in mutierten Elovl2-Mäusen bestätigt.43 Als nächstes bestätigten wir, dass diese Epigenetik-Metabolismus-Alterungs-Achse auch beim Menschen existiert. Erhöhte Werte an AMD-Markern wurden bei ähnlichen Häufungen von ER-Stress, mitochondrialer Dysfunktion und zellulärer Seneszenz in menschlichen primären RPE-Zellen festgestellt. Die Wiederherstellung der mitochondrialen Aktivität durch Nikotinamid reduzierte die Menge an AMD-Markern in menschlichen Elovl2-Knockdown-RPE-Zellen drastisch.

Unser Ergebnis zeigt, dass epigenetische Veränderungen den Stoffwechsel während des Alterns verändern und ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen ermöglichen, die dem epigenetischen und metabolischen Alterungsprozess zugrunde liegen. Stoffwechselstörungen sind ein Auslöser altersbedingter epigenetischer Veränderungen. Mittlerweile kann auch eine Stoffwechselstörung ein Mediator sein, der wechselseitig epigenetische Veränderungen verursacht. Der Mechanismus, wie der Stoffwechsel altersbedingte epigenetische Veränderungen reguliert, muss noch weiter untersucht werden.

Weitere Informationen zu experimentellen Verfahren finden Sie in den ergänzenden Materialien online, Materialien und Methoden.

Alle Mausexperimente wurden gemäß den Richtlinien für die Verwendung von Tieren in der Forschung durchgeführt, die vom Institut für Zoologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften herausgegeben wurden. Mäuse wurden vom Beijing Vital River Laboratory gekauft und in den Tieranlagen des Instituts für Zoologie untergebracht.

Die Daten wurden in unserer vorherigen Arbeit erstellt.11 Kurz gesagt, genomische DNA wurde aus dem Vollblut der Teilnehmer extrahiert. Die Methylierungsfraktionswerte für die autosomalen Chromosomen wurden mit dem Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip gemessen. Die Daten wurden mit der BeadStudio-Software v3.2 analysiert. Annotationsanreicherungstests für den Methylierungsmarker der CpG-Inseln wurden mit dem zweiseitigen exakten Fisher-Test durchgeführt. Das Alterungsmodell wurde in unserer vorherigen Arbeit beschrieben.11 Der Regressionskoeffizient wurde basierend auf diesem Modell berechnet. Die Kovariaten Geschlecht, BMI, Diabetesstatus, ethnische Zugehörigkeit und Charge wurden in das Modell einbezogen und waren von der Bestrafung (Regularisierung) ausgenommen. p-Werte basieren auf einem Modell der kleinsten Quadrate, das mit denselben Termen und Drop-One-F-Tests erstellt wurde.

Wir haben ein auf Aufmerksamkeitsmechanismen basierendes Deep-Learning-Modell namens KeystoneFold entwickelt, das von AlphaFolder 220 und der RoseTTAFold-Architektur inspiriert ist.21 Kurz gesagt, mehrere Sequenzalignments (MSAs) wurden mit HHblits im HH-suite3-Paket47 erstellt, um Merkmale für die Proteine zu generieren. Die Merkmalsmatrizen der Eingabesequenz wurden in den verborgenen Schichten in dreidimensionale Matrizen umgewandelt. Die von Transformer inspirierten Aufmerksamkeitsarchitekturen wurden verwendet, um den langfristigen sequentiellen Kontext von Resten aus bestimmten MSA-Merkmalen zu erfassen. Vollatomstrukturmodelle wurden auf der Grundlage einer Gradientenfaltung mit pyRosetta generiert.48 Die restweise Cɑ-lDDT-Bewertungsfunktion49 wurde verwendet, um endgültige Modelle aus allen untersuchten Strukturen auszuwählen. Das Substratandocken von Elovl2 wurde mit Discovery Studio 3.1 vorbereitet und durchgeführt.

Alle Mausexperimente wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien und -Vorschriften durchgeführt. Zygoten wurden von 6 Wochen alten ICR-superovulierten weiblichen Mäusen, die mit ICR-Männchen gekreuzt wurden, 21 Stunden nach der Injektion von humanem Choriongonadotropin (phCG) gesammelt. Cas9-mRNA und sgRNAs, die auf Elovl2-Exon 3 abzielen (ergänzende Abbildung 1, jeweils 20 ng/μl), wurden 25 Stunden lang bei phCG injiziert. Die Cas9-mRNA wurde in vitro mit dem mMESSAGEmMACHINE® T7 ULTRA Kit (Ambion, AMB1345-5) transkribiert und sgRNAs wurden durch In-vitro-Transkription mit dem MEGAshortscript™ Kit (Ambion, AM1354) synthetisiert.

Menschliche primäre RPE-Zellen wurden aus postmortalem Gewebe einer Augenbank gewonnen und waren von der Ethikgenehmigung ausgenommen. Die menschlichen RPE-Zellen stammten hauptsächlich von gesunden Spendern. Die menschlichen Fibroblastenzellen wurden von ATCC (WI-38, ATCC, CCL-75) erworben. Menschliche Fibroblasten wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 50 U/ml Penicillin-Streptomycin, gehalten. Menschliche RPE-Zellen wurden mit DMEM/F-12 (1:1), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 50 U/ml Penicillin-Streptomycin, kultiviert.

Für den Elovl2-Knockdown wurde ein lentiviraler Vektor (pLL3.7-shElovl2) mit exogen exprimierter shRNA (5'-TGGTGGTACTATTTCTCCAAA-3′) hergestellt und unter Verwendung von Lipofectamin 3000-Reagenz (Thermo Fisher, L3000008) in 293T-Zellen (ATCC) transfiziert, um Lentivirus zu erhalten. Um die Elovl2-Knockdown-Zelllinie aufzubauen, wurden menschliche RPE-Zellen (eine Nacht im Voraus in einer Konzentration von 5 × 105 Zellen/Vertiefung ausgesät) in einer Platte mit 6 Vertiefungen 24 Stunden lang mit dem Lentivirus infiziert, das Elovl2-shRNA enthielt, gefolgt von 24 Stunden h des Gleichgewichts. Die medikamentöse Behandlung erfolgte 48 Stunden nach der Infektion. Um die Elovl2-Knockdown-Zellen zu retten, wurden 10 μg/ml Curcumin (Sigma, C7727) oder 5 mM Nicotinamid (Sigma, N0636) oder DMSO in das Zellkulturmedium gegeben und die Zellen wurden 48 Stunden lang behandelt. H2O2-Behandlungen wurden an ähnlich konfluenten Fibroblastenzellen durchgeführt, um eine Variabilität der H2O2-Wirkung zu vermeiden, da die H2O2-Toxizität umgekehrt mit der Zelldichte zusammenhängt. Kurz gesagt, die Zellen wurden am 2. Tag der Passage 24 Stunden lang mit H2O2 in einer Konzentration von 100 µM in einer Einzeldosis behandelt und dann im Verhältnis 1:3 in frischem DMEM mit 10 % FBS-Medium gespalten, gefolgt von SA-β- Gal-Färbung.

Die Sequenzierungsdaten wurden im Genome Sequence Archive des Beijing Institute of Genomics der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (http://gsa.big.ac.cn/) hinterlegt. Die in diesem Projekt gemeldeten Zugangsnummern für Maus- und Menschendaten lauten CRA002140 und CRA002141. Die maßgeschneiderten Codes zur Vorhersage der 3D-Proteinstruktur und der molekularen Wechselwirkung sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Wir danken QC und JL von Beijing Health OLight Technology Co. Ltd für ihre Hilfe bei OCT- und ERG-Diensten. Wir danken CL, WG und TL vom Institut für Materia Medica, der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften und dem Peking Union Medical College für ihre Hilfe bei der pathologischen Abteilung und den MRT-Diensten. Wir danken Shiwen Li und Xili Zhu vom Institut für Zoologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften für ihre technische Unterstützung. Wir danken ZL, ZX, QQ, CZ, JX und QW für ihre Hilfe und Unterstützung bei der Datenanalyse. Wir danken Eppendorf, Leica und Beckman für die Bereitstellung der Geräte. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Strategic Priority Research Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (XDA16030400 an QZ und WL), der National Natural Science Foundation of China (31621004 an QZ und WL, 31471395 an QZ und 31701286 an GF), Guangzhou, unterstützt Labor (an KZ), die Schlüsselforschungsprojekte der Grenzwissenschaft der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (QYZDY-SSW-SMC002 an QZ), die Schlüsseleinsatzprojekte der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (ZDRW-ZS-2017-4 an WL ), das National Basic Research Program of China (2014cB964801 an WL), die China Postdoctoral Science Foundation (2017M610990 und 2017T100107 an JW), das China National Postdoctoral Program for Innovative Talents (BX201700243 an LW) und das National Key Research and Development Program (2017YFA0103803 bis QZ).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Xin Li, Jiaqiang Wang, LeYun Wang, Yuanxu Gao

Staatliches Schlüssellabor für Stammzellen- und Reproduktionsbiologie, Institut für Zoologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften, 100101, Peking, China

Xin Li, Jiaqiang Wang, LeYun Wang, Guihai Feng, Yu Fei Li, Chao Liu, Xue Wei Yuan, Wei Li und Qi Zhou

Institut für Genommedizin, University of California San Diego, La Jolla, CA, 92037, USA

Xin Li

Medizinische Fakultät, Macau University of Science and Technology, Tapai, Macau, 999078, China

Xin Li & Kang Zhang

Staatliches Schlüssellabor für Mond- und Planetenwissenschaften, Macau University of Science and Technology, Tapai, Macau, 999078, China

Yuanxu Gao

Clinical Translational Innovation Center, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, 610041, China

Yuanxu Gao & Jun Zou

Guangzhou Women and Children Medical Center, Guangzhou Medical University, Guangzhou, 510623, China

Gen Li & Meixin Yu

Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen-Universität, Guangzhou, 510060, China

Ling Zhao und Hong Ouyang

Institut für fortgeschrittene Biotechnologie und School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology, Shenzhen, 518055, China

Jian-Kang Zhu

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XL, JW, QZ und KZ konzipierten und gestalteten die Studie. Alle Autoren führten die Experimente durch. XL, JW, LW, GF, GL, XWY, YG, JZ, MY, YFL, CL, LZ, HO, J.-KZ, QZ und KZ haben die Daten generiert oder analysiert. J.-KZ, QZ und KZ betreuten das Projekt. XL, JW, GF, JKZ, QZ und KZ analysierten die Daten, entwarfen und verfassten das Manuskript. Alle Autoren haben den Artikel gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Jian-Kang Zhu, Wei Li, Qi Zhou oder Kang Zhang.

Die Autoren meldeten ein Patent für Methoden zur Veränderung des Alterns durch Manipulation epigenetischer Marker an. KZ ist einer der Chefredakteure von Signal Transduction and Targeted Therapy, war jedoch nicht an der Bearbeitung des Manuskripts beteiligt.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Li, X., Wang, J., Wang, L. et al. Eine durch altersabhängige DNA-Methylierung verursachte Störung des Fettstoffwechsels beschleunigt das Altern. Sig Transduct Target Ther 7, 162 (2022). https://doi.org/10.1038/s41392-022-00964-6

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Eingegangen: 01. Dezember 2021

Überarbeitet: 24. Februar 2022

Angenommen: 27. Februar 2022

Veröffentlicht: 25. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-022-00964-6

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